腺相关病毒（AAV）样品中的杂质的表征和用于使AAV稳定的调配物组合物的制作方法

本发明总体涉及用于使用尺寸排阻色谱法和分光光度法表征包括腺相关病毒(aav)载体的样品中的核酸杂质的方法。本申请还提供了用于使包装的dna从aav载体中泄漏最小化的方法和组合物。

背景技术：

1、基因疗法通过将适量的治疗基因递送到靶组织而没有显著毒性来介导治疗效果，同时实现长期基因表达，例如通过将遗传物质整合到宿主基因组中。基因疗法可以包含核酸、质粒、病毒、载体或基因工程化的微生物。在所有目前可用的包含逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和aav载体的病毒载体中，aav载体已被广泛用于递送基因疗法的遗传物质。

2、基因疗法产品的评估包含评估制造过程以确保产品安全和质量，以及在产品的制造、储存和分配步骤中评估所述产品。由于基因疗法产品通常作为冷冻溶液的形式储存，因此重要的是表明基因疗法产品经过冻融循环和搅拌应力的稳定性。基于aav载体的基因疗法产品可能会在冻融循环期间发生降解，以产生包含降解的病毒蛋白和dna杂质的降解产品。载体内包装的aav基因组可能会在冻融循环或搅拌期间泄漏。因此，应研究基因疗法产品的各种调配物策略，以制备调配物，从而提高产品稳定性并使产品降解最小化。

3、应当理解，需要在各种储存条件期间表征此类基因疗法产品中的核酸杂质的方法。另外，还需要提供包括aav载体的组合物或调配物，所述aav载体具有使包装的dna从aav载体中泄漏最小化的治疗基因。

技术实现思路

1、本申请提供了用于表征和鉴定包括aav载体或基因疗法产品的样品中的核酸杂质的方法，所述方法包含使用尺寸排阻色谱法和分光光度法。本申请还提供了用于使包装的dna在如冻融循环和搅拌应力等储存条件期间从aav载体中泄漏最小化的方法和组合物，这可能发生在制造、运输、储存和施用期间。

2、本公开提供了一种鉴定含有aav载体的样品中的核酸杂质的方法。在一些示例性实施例中，本公开提供了一种方法，所述方法包括：使含有aav载体的样品与尺寸排阻色谱法(sec)柱接触；使用溶液洗涤所述sec柱以提供至少一种洗脱液；以及使用分光光度计鉴定所述至少一种洗脱液中的核酸杂质。一方面，核酸杂质是aav的单链dna(ssdna)基因组。另一方面，核酸杂质是双链dna(dsdna)。另一方面，本申请的方法进一步包括使用分光光度计测量所述至少一种洗脱液在280nm处的吸光度以及使用分光光度计测量所述至少一种洗脱液在260/280nm处的吸光度比率。一方面，本申请的方法进一步包括基于核酸标准曲线对所述核酸杂质进行定量。一方面，本申请的方法进一步包括用与ssdna特异性结合的荧光染料处理核酸杂质。另一方面，本申请的方法进一步包括在使所述样品与所述sec柱接触之前使所述样品与dna核酸酶接触。在另外的方面，所述sec系统是尺寸排阻超高效液相色谱法(se-uplc)系统。另一方面，本申请的方法进一步包括使所述至少一种洗脱液经受下一代测序(ngs)。

3、本公开至少部分地提供了用于保护aav载体免于泄漏包装的核酸的组合物。在一些示例性实施例中，本公开提供了一种组合物，其包括至少一种aav载体和至少一种赋形剂，其中所述至少一种赋形剂是糖、氨基酸、表面活性剂或多元醇，其中所述至少一种aav载体包括包装的核酸；并且其中所述组合物中的所述至少一种aav载体被保护免于泄漏所述包装的核酸。

4、一方面，本申请的组合物中的aav载体暴露于至少一次冻融循环。一方面，包装的核酸是aav的ssdna基因组，其中所述包装的核酸存在于aav衣壳内。一方面，本申请的组合物的赋形剂以约0.001％至约10％的浓度存在，其中所述组合物进一步包括磷酸盐缓冲盐水和非离子表面活性剂。另一方面，本申请的化组合物中的糖是蔗糖、海藻糖、甘露醇、棉子糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖或麦芽七糖。一方面，本申请的组合物中的氨基酸是脯氨酸。一方面，本申请的组合物中的表面活性剂是泊洛沙姆(poloxamer)188(f68)。一方面，本申请的组合物中的表面活性剂是非离子表面活性剂，其中所述表面活性剂以约0.001％至约0.2％的浓度存在。另一方面，组合物包含蔗糖和泊洛沙姆188。在一具体方面，组合物包含浓度为2.5％至10％的蔗糖和浓度为0.001％至0.2％的泊洛沙姆188。

5、本公开至少部分地提供了用于保护aav载体免于泄漏包装的核酸的方法。在一些示例性实施例中，所述方法包括：获得包含至少一种aav载体的样品；以及向所述样品中添加稳定化组合物以形成保护性调配物，其中所述保护性调配物保护至少一种aav载体免于泄漏包装的核酸，所述稳定化组合物包括至少一种赋形剂，并且所述赋形剂是糖、氨基酸、表面活性剂或多元醇。一方面，所述aav载体暴露于至少一次冻融循环。一方面，包装的核酸是aav的ssdna基因组，其中所述包装的核酸存在于aav衣壳内。

6、另一方面，所述赋形剂以约0.001％至约10％的浓度存在于所述保护性调配物中，其中所述稳定化组合物进一步包括磷酸盐缓冲盐水和非离子表面活性剂。一方面，所述糖是蔗糖、海藻糖、甘露醇、棉子糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖或麦芽七糖。在又另一方面，所述氨基酸是脯氨酸。一方面，表面活性剂是泊洛沙姆188(f68)。一方面，本申请的组合物中的表面活性剂是非离子表面活性剂，其中所述表面活性剂以约0.001％至约0.2％的浓度存在于保护性调配物中。另一方面，稳定化组合物包含蔗糖和泊洛沙姆188。在一具体方面，稳定化组合物在保护性调配物中包含最终浓度为2.5％至10％的蔗糖，并且稳定化组合物在保护性调配物中包含终浓度为0.001％至0.2％的泊洛沙姆188。

7、当结合以下描述和附图考虑时，将更好地认识和理解本发明的这些方面和其它方面。以下描述虽然表明各个实施例及其众多具体细节，但是以说明而非限制的方式给出的。在本发明的范围内可以进行许多替换、修改、添加或重新排列。

技术特征：

1.一种鉴定含有腺相关病毒(aav)载体的样品中的核酸杂质的方法，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸杂质是aav的单链dna基因组。

3.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括用荧光染料处理所述核酸杂质。

4.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使用所述分光光度计测量所述至少一种洗脱液在280nm处的吸光度。

5.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使用所述分光光度计测量所述至少一种洗脱液在260/280nm处的吸光度比率。

6.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括基于核酸标准曲线对所述核酸杂质进行定量。

7.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在使所述样品与所述sec柱接触之前使所述样品与dna核酸酶接触。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述sec系统是尺寸排阻超高效液相色谱法(se-uplc)系统。

9.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使所述至少一种洗脱液经受下一代测序(ngs)。

10.一种组合物，其包括至少一种腺相关病毒(aav)载体和至少一种赋形剂，其中所述至少一种赋形剂是糖、氨基酸、表面活性剂或多元醇，其中所述至少一种aav载体包括包装的核酸；并且其中所述组合物中的所述至少一种aav载体被保护免于泄漏所述包装的核酸。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述至少一种aav载体暴露于至少一次冻融循环。

12.根据权利要求10所述的组合物，其中所述包装的核酸是来自aav基因组的单链dna，其中所述包装的核酸存在于aav衣壳内。

13.根据权利要求10所述的组合物，其中所述赋形剂以约0.001％至约10％的浓度存在，其中所述组合物进一步包括磷酸盐缓冲盐水和非离子表面活性剂。

14.根据权利要求10所述的组合物，其中所述糖是蔗糖、海藻糖、甘露醇、棉子糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖或麦芽七糖。

15.根据权利要求10所述的组合物，其中所述氨基酸是脯氨酸。

16.根据权利要求10所述的组合物，其中所述表面活性剂是泊咯沙姆(poloxamer)188。

17.根据权利要求10所述的组合物，其中所述表面活性剂是非离子表面活性剂，其中所述表面活性剂以约0.001％至约0.2％的浓度存在。

18.根据权利要求10所述的组合物，其中所述组合物包含蔗糖和泊洛沙姆188。

19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述蔗糖以2.5％至10％的浓度存在，并且所述泊洛沙姆188以0.001％至0.2％的浓度存在。

20.一种用于保护腺相关病毒(aav)载体免于泄漏包装的核酸的方法，所述方法包括：

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述aav载体暴露于至少一次冻融循环。

22.根据权利要求20所述的方法，其中所述包装的核酸是aav的单链dna基因组，其中所述包装的核酸存在于aav衣壳内。

23.根据权利要求20所述的方法，其中所述赋形剂以约0.001％至约10％的浓度存在于所述保护性调配物中，其中所述稳定化组合物进一步包括磷酸盐缓冲盐水和非离子表面活性剂。

24.根据权利要求20所述的方法，其中所述糖是蔗糖、海藻糖、甘露醇、棉子糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖或麦芽七糖。

25.根据权利要求20所述的方法，其中所述氨基酸是脯氨酸。

26.根据权利要求20所述的方法，其中所述表面活性剂是泊咯沙姆188。

27.根据权利要求20所述的方法，其中所述表面活性剂是非离子表面活性剂，其中所述表面活性剂以约0.001％至约0.2％的浓度存在于所述保护性调配物中。

28.根据权利要求20所述的方法，其中所述稳定化组合物包含蔗糖和泊洛沙姆188。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述蔗糖以2.5％至10％的浓度存在于所述保护性调配物中，并且所述泊洛沙姆188以0.001％至0.2％的浓度存在于所述保护性调配物中。

技术总结
提供了用于表征腺相关病毒(AAV)样品或生物制药中的DNA杂质的方法，所述方法包含使用尺寸排阻色谱法和分光光度法。还提供了用于使包装的DNA从AAV载体中泄漏最小化的方法和组合物，所述方法包含使用如糖、氨基酸、表面活性剂或多元醇等赋形剂。

技术研发人员：B·姜,D·刘,F·特祖尔
受保护的技术使用者：瑞泽恩制药公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14