用于核酸分离的组合物和方法与流程

背景技术：

1、基于mrna的药物技术的最新发展显示出疫苗产生、蛋白质替代和癌症治疗的巨大前景。这些技术包括通过体外转录从dna模板生成特定mrna，随后将mrna递送到患者体内。这些新的突破性技术需要强大而可靠的工具来纯化新转录的rna及其随后的浓缩。目前的黄金标准rna纯化方法是高效液相色谱法(hplc)。然而，这种技术非常昂贵(每10克0.5-3千万美元)，并且占mrna药物的生产成本的很大一部分。

2、固体支持物，诸如寡(dt)珠，可以提供用于纯化聚(a)+rna的可扩展且自动化友好的工具。然而，最后的洗脱步骤可能会导致rna样品的稀释，这然后需要额外的浓缩步骤，从而增加了该程序的时间和成本。

3、因此，需要进一步有效的rna纯化方法。具体地，对于研究目的和rna治疗而言，开发有效的并降低rna生产成本的rna纯化方法将是有益的。

技术实现思路

1、本发明提供了用于纯化和浓缩rna的有效方法，这在寻求分离已经使用标准程序诸如体外转录反应合成的rna时可能是有用的。这些方法还可用于从其他样品诸如血液或血清中分离rna。

2、在一个方面，本发明提供了一种从样品中分离rna的方法。该方法包括提供包含rna的样品、包含低聚乙二醇和盐的结合溶液以及具有亲水表面的固体支持物。该低聚乙二醇包含呈线性排列的约2至约70个乙二醇单元。该方法还包括在允许样品中的rna与固体支持物的表面结合的条件下，使样品与结合溶液和固体支持物接触，从而提供与残余溶液接触的具有结合rna的固体支持物；以及从该残余溶液中分离具有结合rna的该固体支持物。在样品中的rna与固体支持物的表面结合过程中，低聚乙二醇以至少约35％v/v的浓度存在，并且盐以介于约1m和约2m之间的浓度存在。

3、第二方面提供了一种用于产生纯化的核糖核酸(rna)分子的方法。该方法包括通过磁场将第一磁珠固定在适当位置，其中体外转录(ivt)模板与第一磁珠连接。在ivt发生的条件下，使第一磁珠与适用于模板的ivt的试剂混合物接触，从而产生rna分子。然后将rna分子与第一磁珠分离，从而产生纯化的rna分子。在允许纯化的rna分子在洗涤过程中保持与第二磁珠缔合的条件下，使纯化的rna分子与第二磁珠接触。然后洗涤第二磁珠，同时通过磁场将第二磁珠固定在适当位置。洗涤后，纯化的rna分子从与第二磁珠的缔合中释放，从而产生高度纯化的rna分子。上文针对第二方面概述的步骤可以重复至少一次，其中紧邻的前一循环(或每个紧邻的前一循环)的第二磁珠被重新用作下一循环中的第二磁珠。另外，紧邻的前一循环(或每个紧邻的前一循环)的第一磁珠也可以被重新用作下一循环中的第一磁珠。

4、第三方面提供了一种试剂盒。该试剂盒包含含有水性低聚乙二醇和盐的结合溶液，其中低聚乙二醇包含呈线性排列的约2至约70个乙二醇单元，并且其中低聚乙二醇以至少约35％v/v的浓度存在并且盐以介于约1m和约2m之间的浓度存在。该试剂盒还包含具有亲水表面的固体支持物。

5、在第四方面，本发明提供了结合溶液从样品溶液中分离rna到固体支持物的用途。结合溶液包含浓度为至少约45％v/v的低聚乙二醇和以介于约1.2m和约2.5m之间的浓度存在的盐。低聚乙二醇包含呈线性排列的约2至约70个乙二醇单元，诸如例如四乙二醇。

6、在第五方面，本发明提供了磁珠从样品溶液中分离rna的用途。磁珠包括亲水表面和约30emu/g至约90emu/g的饱和质量磁化强度。磁珠是可重复使用的，使得该用途包括从样品溶液中分离rna的2个或更多个循环，每个循环包括在结合溶液的存在下使磁珠与样品接触，从残余溶液中分离出具有结合rna的固体支持物，以及使所分离的固体支持物与洗脱缓冲液接触。

技术特征：

1.一种从样品中分离rna的方法，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述结合过程中，所述低聚乙二醇以介于约35％v/v和约50％v/v之间的浓度存在。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述低聚乙二醇包含呈线性排列的约2至约20个乙二醇单元；

4.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述低聚乙二醇是或包含四乙二醇。

5.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述盐选自或包含碱金属卤化物或碱土金属卤化物；

6.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述盐是或包含氯化钠。

7.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述结合溶液包含提供约6至约9的ph的缓冲液；

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述缓冲液包含或选自tris、tris/edta、pbs、柠檬酸盐、2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)或水；

9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述缓冲液包含tris，任选地浓度为约10mm至约100mm的tris。

10.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述样品i)包括体外转录反应。

11.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述样品i)以溶液的形式提供。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述使所述样品与所述固体支持物和所述结合溶液接触包括使所述固体支持物与所述样品接触以形成混合物，然后使所述混合物与所述结合溶液接触。

13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中所述样品i)以比所述结合溶液ii)更低的体积提供，任选地其中所述样品i)以不超过所述结合溶液ii)的体积的约60％的体积提供。

14.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述方法还包括：

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述洗涤缓冲液包含约50％v/v至约90％v/v乙醇，任选地约60％v/v至约80％v/v乙醇。

16.根据权利要求14或权利要求15所述的方法，还包括重复步骤d)。

17.根据任一前述权利要求所述的方法，还包括：

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述洗脱缓冲液是或包含tris/edta、tris或水；

19.根据权利要求17或权利要求18所述的方法，其中所述洗脱缓冲液以每mg(干重)分离的具有结合的rna的固体支持物小于100μl的体积提供。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液的体积小于所述包含rna的样品的体积，使得所述方法从所述样品中纯化并且浓缩所述rna。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述洗脱缓冲液的体积比所述包含rna的样品的体积小至少约50％；任选地，其中所述洗脱缓冲液的体积比所述包含rna的样品的体积小至少约66％；进一步任选地，其中所述洗脱缓冲液的体积比所述包含rna的样品的体积小至少约75％。

22.根据权利要求17至21中任一项所述的方法，还包括：

23.根据权利要求22所述的方法，其中步骤g)包括重复步骤a)至f)至少2、3、4、5或6次。

24.根据权利要求22或权利要求23所述的方法，其中所述固体支持物包含磁珠，所述磁珠具有约30emu/g至约90emu/g的饱和质量磁化强度。

25.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其中紧邻的前一循环(或每个紧邻的前一循环)的步骤f)的所述经洗脱的固体支持物被重新用作下一循环的步骤a)中的所述具有亲水表面的固体支持物，而在每个步骤g)与a)之间不对所述固体支持物进行任何洗涤。

26.一种用于产生纯化的核糖核酸(rna)分子的方法，所述方法包括：

27.根据权利要求26所述的方法，其中步骤g)包括重复步骤a)至f)至少2、3、4、5或6次。

28.根据权利要求26或权利要求27所述的方法，其中所述第一磁珠是链霉亲和素包被的磁珠，并且所述第二磁珠是羧酸包被的珠。

29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中所述第一磁珠和/或所述第二磁珠具有约30emu/g至约90emu/g的饱和质量磁化强度。

30.根据权利要求26至29中任一项所述的方法，其中接触步骤d)的条件包括在包含低聚乙二醇和盐的结合溶液的存在下使所述纯化的rna分子与所述第二磁珠接触，所述低聚乙二醇包含呈线性排列的约2至约70个乙二醇单元，其中在所述接触过程中，所述低聚乙二醇以至少约35％v/v的浓度存在并且所述盐以介于约1m和约2m之间的浓度存在。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述结合溶液的组成根据权利要求2至9中任一项进一步定义。

32.根据权利要求26至31中任一项所述的方法，其中步骤e)洗涤包括使用包含水性c1-c6醇和/或水性c2-c10多元醇的洗涤缓冲液；任选地，其中所述洗涤缓冲液包含约50％v/v至约90％v/v乙醇。

33.根据权利要求26至32中任一项所述的方法，其中所述ivt模板是合成dna片段或通过聚合酶链反应(pcr)产生；

34.一种试剂盒，包含：

35.根据权利要求34所述的试剂盒，其中所述结合溶液根据权利要求2至9中任一项进一步定义。

36.根据权利要求34或35所述的试剂盒，还包含含有水性c1-c6醇和/或水性c2-c10多元醇的洗涤缓冲液，

37.根据权利要求34至36中任一项所述的试剂盒，还包含洗脱缓冲液；

38.结合溶液将rna从样品溶液中分离到固体支持物的用途，

39.根据权利要求38所述的用途，其中所述低聚乙二醇包含呈线性排列的约2至约20个乙二醇单元；

40.根据权利要求38或权利要求39所述的用途，其中所述低聚乙二醇以介于约50％v/v和约70％v/v之间的浓度存在。

41.根据权利要求38至40中任一项所述的用途，其中所述盐选自或包含碱金属卤化物或碱土金属卤化物；

42.根据权利要求38至41中任一项所述的用途，其中所述结合溶液包含提供约6至约9的ph的缓冲液；

43.根据权利要求42所述的用途，其中所述缓冲液包含或选自tris、tris/edta、pbs、柠檬酸盐、柠檬酸钠、2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)或水；

44.根据权利要求42或43所述的用途，其中所述缓冲液包含tris，任选地浓度为约10mm至约100mm的tris。

技术总结
本发明提供了一种从样品中分离RNA的方法，该方法包括提供：包含RNA的样品、包含低聚乙二醇和盐的结合溶液以及具有亲水表面的固体支持物。该方法还包括在允许该样品中的该RNA与该固体支持物的该表面结合的条件下，使该样品与该结合溶液和该固体支持物接触，从而提供与残余溶液接触的具有结合RNA的固体支持物；以及从该残余溶液中分离具有结合RNA的该固体支持物。在该RNA与该固体支持物的该表面结合过程中，低聚乙二醇以至少约35％v/v的浓度存在，并且该盐以介于约1M和约2M之间的浓度存在。还提供了用于产生纯化的RNA的方法，该方法包括用第一磁珠体外转录产生RNA分子以及用第二磁珠纯化。还提供了试剂盒和用途。

技术研发人员：L·约伯特,M·波斯奈斯,H·K·林德斯特罗姆
受保护的技术使用者：生命技术股份公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14