插入段和标识无变性测序方法与流程

本发明公开了用于二代测序的方法和试剂盒。

背景技术：

1、二代测序(ngs)已经彻底改变了分子生物学，使确定基因组序列的速度大大加快，成本大大降低。为了对脱氧核糖核酸(dna)和其他多核苷酸进行二代测序，必须对多核苷酸进行处理以用于测序系统，通常是通过添加具有已知序列的寡核苷酸，一般称为接头(adaptor)。这些已知的接头使多核苷酸能与测序系统兼容，例如通过添加将退火以与测序仪流动芯片上的寡核苷酸互补的序列。接头可以包含多个功能区，如用于连接测序仪、测序引物退火和/或生物样品索引的区域(即样品条形码(sbc)或唯一分子条形码(mbc))。sbc和mbc可以与未知dna序列(插入段)的目的多核苷酸样品一起测序，以分别识别所述插入段的生物来源和独特性。

2、边合成边测序(sbs)系统使用四个荧光标记的核苷酸对流动芯片表面的数千万个簇进行并行测序。在每个测序周期中，单个标记的脱氧核苷三磷酸(dntp)添加到核酸链中。核苷酸标签作为聚合的终止剂，因此在每个dntp并入后，荧光染料被成像以识别碱基，然后进行酶解以并入下一个核苷酸。由于所有四个可逆的终止子结合的dntps(a、c、t、g)都是以单独的分子形式存在，自然竞争使并入的偏差最小。每个核苷酸的识别是根据每个周期中测量的标签的信号进行的。其结果是一种按顺序识别目的多核苷酸中的每个核苷酸的测序方法。

3、在许多sbs系统中，通过标记核苷酸形成互补链来对插入段进行测序，然后通过变性将所述插入段测序合成的链去除。所述变性步骤是有必要的，因为来自插入段的测序信号会干扰后续的标识测序。

4、在一些情况中，多核苷酸如dna通过一个或多个接头贴附在测序系统(如流动芯片、微珠)的固体表面上，并进行扩增以增加信号强度。一般来说，通过将样品分割成多核苷酸片段，将一个或多个接头附着在片段上形成多核苷酸结构体，并对多核苷酸片段进行扩增，测序文库被制备以用于测序。这些片段可以用一个或多个扩增引物进行扩增。在sbs系统中，测序引物与多核苷酸结构体上的引物结合位点杂交，随着测序引物延伸，以酶促方式添加标记的双脱氧核苷酸。检测和分析标记的双脱氧核苷酸的信号，从而确定序列。

5、目的多核苷酸可以用单端或双端测序方法进行分析。单端测序方法包括从一端向相反端读取基因组片段。单端测序读取为每个片段读取一次，对应于片段两端之一的n个碱基对，其中n是测序周期数。双端测序方法包括从一端到另一端读取一个核酸片段，直至读取指定的长度，然后从片段的另一端开始再进行一轮读取。对于双端测序方法，需进行正向序列读取和反向序列读取，并将数据配对形成邻接序列。这些序列与参考样本进行比对，以确定变异。

6、ngs测序系统(如上述系统)通常需要在开始新的引物退火和测序之前，将由加入的标记核苷酸形成的先前合成的链变性(与插入段分离)。例如，在对sbcs和/或mbcs进行测序的第二测序引物退火之前需对插入段进行测序后产生的互补链进行变性。或者，在对dna片段进行测序的引物退火之前，需对sbcs和/或mbcs进行测序时产生的合成链进行变性。

7、然而，变性步骤是耗时的，并且可能破坏dna片段，也有可能引入测序误差。因此，本领域需要一种不需要变性步骤的测序方法，特别是具有与高通量测序分析结合效用的测序方法。

技术实现思路

1、本发明提供了用于二次测序的方法和试剂盒。本方法一般包括对存在于多核苷酸结构体中的插入段和标识进行测序，并且没有变性步骤，从而减少测序时间，避免潜在的测序误差，和/或提供其他优势等。

2、本发明的这些和其他特点和优点从下面的详细描述以及所附的权利要求来看是显而易见的。

技术特征：

1.一种对多核苷酸结构体中的插入段和标识进行测序的方法，包括：

2.根据权利要求1的方法，所述方法包括延伸第一引物，并在第二引物退火前检测添加的标记核苷酸至少七十个测序周期。

3.根据权利要求1的方法，进一步包括在添加标记核苷酸后，通过添加未标记核苷酸以延伸双链插入段部分，直至互补链完全延伸插入段。

4.根据权利要求1的方法，进一步包括在加入标记核苷酸之后，向双链插入段部分加入阻断核苷酸。

5.根据权利要求4的方法，其中所述阻断核苷酸是双脱氧核苷酸。

6.根据权利要求1的方法，其中所述多核苷酸结构体包括捕获位点、用于第一引物的第一引物结合位点、标识、用于第二引物的第二引物结合位点以及插入段。

7.根据权利要求6的方法，其中所述标识包括样品标识和/或分子标识。

8.根据权利要求6的方法，其中第一引物结合位点与插入段的5'端邻接。

9.根据权利要求6的方法，其中第二引物结合位点与样品标识或分子标识邻接。

10.一种对多核苷酸结构体中的插入段和标识进行测序的方法，包括：

11.根据权利要求10的方法，所述方法包括在延伸第二引物之前，将与标识互补的链连结至第二引物。

12.根据权利要求10的方法，进一步包括在添加标记核苷酸后，通过添加未标记核苷酸延伸双链标识部分，直至互补链完全延伸标识。

13.根据权利要求10的方法，进一步包括在添加标记核苷酸后，向双链标识部分添加阻断核苷酸。

14.根据权利要求13的方法，其中所述阻断核苷酸是双脱氧核苷酸。

15.根据权利要求10的方法，其中所述多核苷酸结构体包括捕获位点、用于第一引物的第一引物结合位点、标识、用于第二引物的第二引物结合位点以及插入段。

16.根据权利要求15的方法，其中所述标识包括样品标识和/或分子标识。

17.根据权利要求15的方法，其中所述标识包括5'端和3'端，并且第一引物结合位点与标识的5'端邻接。

18.根据权利要求15的方法，其中第二引物结合位点与插入段的5'端邻接。

19.一种用于对目的多核苷酸进行测序的试剂盒，所述试剂盒包括：

20.根据权利要求19的试剂盒，所述试剂盒包括阻断核苷酸，其中所述阻断核苷酸是双脱氧核苷酸。

技术总结
本发明公开了用于二代测序的方法和试剂盒。在一些实施例中，本方法包括没有中间变性步骤的插入段测序和标识测序。本发明还提出插入段序列减弱的测序信号，使用未标记核苷酸形成双链插入段结构，以及使用合成阻断核苷酸。

技术研发人员：郑京秀
受保护的技术使用者：安捷伦科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15