突变葡萄糖脱氢酶的制作方法

本发明涉及一种突变葡萄糖脱氢酶。更具体而言，本发明涉及一种提高了葡萄糖脱氢酶比活性的多肽、编码该多肽的dna、重组载体、转化体、酶制剂、以及该多肽的用途。

背景技术：

1、糖尿病患者逐年增加，糖尿病患者、特别是胰岛素依赖性的患者为了控制血糖值，需要日常地监视血糖值。近年来，使用能够使用酶简便且准确地测定的电化学生物传感器的自我血糖测定仪(葡萄糖传感器)被广泛使用。

2、作为葡萄糖传感器中使用的酶，利用以葡萄糖为底物的葡萄糖氧化酶(以下，也记载为“go”)或葡萄糖脱氢酶(以下，也记载为“gdh”)。

3、go具有对葡萄糖的特异性高、热稳定性优异的优点，另一方面，被指出在使用其的测定中，容易受到测定样品中的溶解氧的影响，溶解氧对测定结果造成影响的问题。为了解决该问题，开发了fad依赖性的gdh(以下，为fad-gdh)。但是，已知fad-gdh对木糖反应，因此，鉴于在糖尿病判定检查时，不仅实施经口葡萄糖负荷试验，还实施经口木糖负荷试验、经静脉木糖负荷试验，在使用fad-gdh的情况下，在上述负荷试验时对血糖值造成影响成为问题。

4、因此，作为弥补go和gdh的两个缺点的酶，在专利文献1中报告取得了使go突变为gdh的fad-gdh。

5、现有技术文献

6、专利文献

7、专利文献1：国际公开第2011/068050号

技术实现思路

1、发明所要解决的技术问题

2、使go突变的fad-gdh虽然弥补了go和gdh的两个缺点，是底物特异性优异的酶，但其比活性有改善的余地。

3、因此，本发明的目的在于提供一种提高了比活性的葡萄糖脱氢酶。

4、用于解决技术问题的技术方案

5、本发明人进行了使go突变的fad-gdh(序列号1)的x射线晶体结构分析，结果着眼于第538位组氨酸受到空间位阻的可能性，以消除该部位的空间位阻为目的，研究了对附近的第578位蛋氨酸的突变导入。其结果发现，通过导入规定的突变，能够提高比活性。本发明是基于该见解完成的。即，本发明提供以下记载的方式的发明。

6、项1.如以下(1)～(3)的任一项所示的多肽：

7、(1)包含在序列号1所示的氨基酸序列中第578位的氨基酸残基被替换为缬氨酸残基或苯丙氨酸残基而成的氨基酸序列的多肽，

8、(2)在序列号1所示的氨基酸序列中的第578位的氨基酸残基被替换为缬氨酸残基或苯丙氨酸残基的氨基酸序列中，除了导入所述替换的氨基酸残基以外的1个或多个氨基酸残基被替换、添加、插入或缺失而成的多肽，且该多肽与包含序列号1所示的氨基酸序列的多肽相比，葡萄糖脱氢酶活性提高，以及

9、(3)在序列号1所示的氨基酸序列中的第578位的氨基酸残基被替换为缬氨酸残基或苯丙氨酸残基的氨基酸序列中，相对于序列号1所示的氨基酸序列的除了导入所述替换的氨基酸残基以外的序列一致性为70％以上的多肽，且该多肽与包含序列号1所示的氨基酸序列的多肽相比，葡萄糖脱氢酶活性提高。

10、项2.一种dna，其编码项1所述的多肽。

11、项3.一种表达盒或重组载体，其包含项2所述的dna。

12、项4.一种转化体，其通过项3所述的表达盒或重组载体转化宿主而得到。

13、项5.一种项1所述的多肽的制造方法，其包括培养项4所述的转化体的工序。

14、项6.一种酶制剂，其包含项1所述的多肽。

15、项7.一种葡萄糖测定用试剂，其包含项1所述的多肽。

16、项8.一种葡萄糖测定方法，其包括使用项1所述的多肽测定试样中的葡萄糖的工序。

17、项9.一种葡萄糖测定用试剂盒，其包含项7所述的葡萄糖测定用试剂。

18、项10.一种葡萄糖传感器，其包含不溶性支撑体和固定于所述不溶性支撑体的项1所述的多肽。

19、项11.一种葡萄糖减少剂，其包含项1所述的多肽。

20、项12.一种葡萄糖减少的组合物的制造方法，其包括以下工序：使用项1所述的多肽，减少选自由食品组合物、化妆品组合物和医药组合物组成的组中的组合物中的葡萄糖。

21、发明效果

22、根据本发明，提供一种提高了比活性的葡萄糖脱氢酶。

技术特征：

1.如以下(1)～(3)的任一项所示的多肽：

2.一种dna，其特征在于，编码权利要求1所述的多肽。

3.一种表达盒或重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述的dna。

4.一种转化体，其特征在于，通过权利要求3所述的表达盒或重组载体转化宿主而得到。

5.权利要求1所述的多肽的制造方法，其特征在于，包括培养权利要求4所述的转化体的工序。

6.一种酶制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的多肽。

7.一种葡萄糖测定用试剂，其特征在于，包含权利要求1所述的多肽。

8.一种葡萄糖测定方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述的多肽测定试样中的葡萄糖的工序。

9.一种葡萄糖测定用试剂盒，其特征在于，包含权利要求7所述的葡萄糖测定用试剂。

10.一种葡萄糖传感器，其特征在于，包含不溶性支撑体和固定于所述不溶性支撑体的权利要求1所述的多肽。

11.一种葡萄糖减少剂，其特征在于，包含权利要求1所述的多肽。

12.一种葡萄糖减少的组合物的制造方法，其特征在于，包括以下工序：使用权利要求1所述的多肽，减少选自由食品组合物、化妆品组合物和医药组合物组成的组中的组合物中的葡萄糖。

技术总结
本发明提供一种提高了比活性的葡萄糖脱氢酶。包含在序列号1所示的氨基酸序列中第578位的氨基酸残基被替换为缬氨酸残基或苯丙氨酸残基的氨基酸序列的多肽和该多肽的不同体呈现提高的葡萄糖脱氢酶活性。

技术研发人员：西尾亨一,津川若子,早出广司
受保护的技术使用者：天野酶制品株式会社
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14