聚合酶突变体以及与3'-OH未封闭的可逆终止子一起使用的制作方法

本发明涉及突变聚合酶和使用此类突变聚合酶用于多核苷酸测序、引物延伸反应和其他应用的方法。

背景技术：

1、聚合酶天然存在于生物体中以复制和维持其基因组。聚合酶已经在生物技术领域中广泛用于多种应用，包括pcr和测序。聚合酶通过检测核苷酸碱基之间的互补性和/或识别寡核苷酸链的结构特征，并充当用于核苷酸和链的3′端之间的反应的酶，使得能够复制dna或rna。仍然需要用于各种生物技术应用的聚合酶，其具有改进的核苷酸掺入，特别是被修饰以在核酸聚合过程中充当可逆终止子的核苷酸的掺入。

2、therminator dna聚合酶是b家族嗜热球菌属物种(thermococcus sp.)9°n-7dna聚合酶的衍生物。therminator可从new england biolabs,inc.(伊普斯威奇，马塞诸塞州)商购获得，并且其特性和应用最近综述于gardner等人“therminator dna polymerase:modified nucleotides and unnatural substrates”,front.mol.biosci.,2019年4月24日(doi.org/10.3389/fmolb.2019.00028)中。

3、激烈火球菌(pyrococcus furiosus，pfu)是一种极端嗜热的古细菌物种，最初是从温度在90℃与100℃之间的地热加热的海洋沉积物中分离出来的。激烈火球菌拥有b家族dna聚合酶，所述聚合酶已用于聚合酶链式反应(pcr)和其他生物技术应用。参见pfuturbodna聚合酶指导手册，修订版g0，agilent technologies,inc.2015,2020；elshawadfy等人,“dna polymerase hybrids derived from the family-b enzymes of pyrococcusfuriosus and thermococcus kodakarensis:improving performance in thepolymerase chain reaction.”front microbiol.2014年5月27日；5:224.doi:10.3389/fmicb.2014.00224。

4、许多野生型和突变dna聚合酶已经用于或有潜力用于多种生物技术应用中，特别是在它们具有掺入修饰的核苷酸的能力时。此类dna聚合酶可用于多核苷酸测序、克隆、pcr或其他扩增、单核苷酸多态性(snp)检测、全基因组扩增(wga)、合成生物学、分子诊断和其他应用。

5、dna聚合酶的一个潜在应用是酶介导的寡核苷酸合成(tieos，非模板依赖性酶促寡聚物合成)。tieos是一种从天然和修饰的核苷酸产生长核酸聚合物的方法。参见jensen等人,“template-independent enzymatic oligonucleotide synthesis(tieos):itshistory,prospects,and challenges”,(2018)biochemistry 57:1821-32。目前的方法将非模板依赖性dna聚合酶与可逆修饰的终止子结合以将寡核苷酸延长控制为每个循环添加单个碱基。tieos的优选酶是末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)。tdt被归类为x家族dna聚合酶，在体内以非模板依赖性方式添加核苷酸以增加哺乳动物的抗原受体多样性。tdt以低于100％的效率掺入可逆终止子，这限制了所得合成寡核苷酸的长度和保真度。迄今为止，最长的酶促合成的寡核苷酸由dna script使用工程化的x家族dna聚合酶报道(280mer，99.4％逐步产率)。参见eisenstein(2020)nature biotechnology 38:1113-1115；和美国专利号10,752,887。此外，许多开发用于边合成边测序(sequencing-by-synthesis)的可逆终止子在从核苷酸的糖(3′-oh封闭)或碱基(3′-oh未封闭)去除终止基团后留下疤痕或修饰。

6、需要用于多核苷酸测序和其他生物技术应用的聚合酶，其具有改进的掺入修饰的核苷酸的能力，包括修饰为用作可逆终止子的核苷酸。还需要以高掺入和终止效率以非模板依赖性方式掺入无疤可逆终止子的酶。

技术实现思路

1、作为本发明的一个方面，提供了突变聚合酶。所述突变聚合酶包含与seq id no:1至少80％相同的氨基酸序列，并且还包含在与本文鉴定的pfu聚合酶中的氨基酸位置功能等同的一个或多个位置处的至少一个氨基酸突变。在一些实施方案中，所述聚合酶包含在与pfu聚合酶中的位置486功能等同的位置处的突变，和/或包含在与pfu聚合酶中的位置546功能等同的位置处的突变，和/或包含在与pfu聚合酶中的位置477功能等同的位置处的突变。示例性突变聚合酶包括那些包含seq id no:2、seq id no:9、seq id no:10、seq idno:4或seq id no:5的氨基酸序列的聚合酶。

2、作为本发明的另一个方面，提供了包含如本文所述的可逆终止子和突变聚合酶的组合物。在一些实施方案中，所述可逆终止子是3′-oh未修饰的可逆终止子(例如闪电终止子(lightning terminator))。参见例如，例如，weidong wu等人,“termination of dnasynthesis by n6-alkylated,not 3′-o-alkylated,photocleavable 2′-deoxyadenosinetriphosphates,”nucleic acids research,第35卷,第19期,2007年10月1日,6339-6349页；vladislav a.litosh等人,“improved nucleotide selectivity and termination of3′-oh unblocked reversible terminators by molecular tuning of 2-nitrobenzylalkylated homedu triphosphates,”nucleic acids research,第39卷,第6期,2011年3月1日,第e39页；和brian p.stupi等人,“stereochemistry of benzylic carbonsubstitution coupled with ring modification of 2-nitrobenzyl groups as keydeterminants for fast-cleaving reversible terminators”,angew.chem.int.ed.2012,51,1724 -1727；andrew f.gardner等人,“rapidincorporation kinetics and improved fidelity of a novel class of 3′-ohunblocked reversible terminators”,nucleic acids research,第40卷,第15期,2012年8月1日,7404-7415页。

3、作为另一个方面，提供了包含3′-oh未封闭的可逆终止子和突变聚合酶的组合物。所述突变聚合酶包含与seq id no:2至少96％相同的氨基酸序列，并且包含在与pfu聚合酶中的k477、a486和y546处的氨基酸位置功能等同的位置处的氨基酸突变。

4、作为另一个方面，提供了一种将核苷酸掺入包含核酸的引发链的方法。所述方法包括在足以进行掺入反应的条件下，使所述引发链与核苷酸和突变聚合酶接触。所述突变聚合酶包含与seq id no:2至少96％相同的氨基酸序列，并且包含在与pfu聚合酶中的k477、a486和y546处的氨基酸位置功能等同的位置处的氨基酸突变。

5、本发明的另一方面涉及一种多核苷酸测序的方法。所述方法包括(a)形成包含模板和引发链的双链体，其中所述模板包含待测序的靶核酸和与所述引发链的至少一部分互补的引物结合位点；(b)将所述引发链与可逆终止子核苷酸和突变聚合酶组合，其中所述突变聚合酶包含与seq id no:2至少96％相同的氨基酸序列，并且包含在与pfu聚合酶中的k477、a486和y546处的氨基酸位置功能等同的位置处的氨基酸突变；(c)在模板依赖性反应中在引发链的3′端掺入所述可逆终止子；和(d)鉴定掺入的可逆终止子核苷酸，从而确定所述模板的序列。

6、作为本发明的另一个方面，提供了一种包含引发链、3′-oh未封闭的可逆终止子和突变聚合酶的组合物。所述突变聚合酶包含与seq id no:1至少80％(可替代地，至少85％、90％或95％)相同的氨基酸序列。所述突变聚合酶还包含在与pfu聚合酶中的位置l270、e330、q332、l333、l409、p451、l453、l457、e476、l489、l490、n492、f494、y497和e581功能等同的位置处的一个或多个突变。所述突变聚合酶的掺入活性比seq id no:11的dna聚合酶的掺入活性高至少4倍。

7、作为又一方面，提供了一种将3′-oh未修饰的可逆终止子掺入引发链中的方法。所述方法包括在足以进行掺入反应的条件下，使引发链与3′-oh未修饰的可逆终止子和突变聚合酶接触。所述突变聚合酶包含与seq id no:1至少80％相同的氨基酸序列和在与pfu聚合酶中的位置l270、e330、q332、l333、l409、p451、l453、l457、e476、l489、l490、n492、f494、y497和e581功能等同的位置处的一个或多个突变。所述方法还包括在引发链的3′端掺入3′-oh未修饰的可逆终止子。

8、作为另一个方面，提供了一种包含引发链、3′-oh未修饰的可逆终止子和突变聚合酶的组合物。所述突变聚合酶与seq id no:2至少96％相同，并且包含：在与pfu聚合酶中的位置546功能等同的位置处的y546h突变；在与pfu聚合酶中的位置409功能等同的位置处的l409y、l409h或l409f突变；以及在与pfu聚合酶中的位置486功能等同的位置处的a486x突变，其中x是除丙氨酸之外的任何氨基酸。

9、作为本发明的另一个方面，提供了一种在非模板依赖性反应中将单个核苷酸掺入引发链的方法。所述方法包括将引发链与3′-oh未修饰的可逆终止子和突变聚合酶组合。所述突变聚合酶与seq id no:2至少96％相同，并且包含：在与pfu聚合酶中的位置546功能等同的位置处的y546h突变；在与pfu聚合酶中的位置409功能等同的位置处的l409y、l409h或l409f突变；以及在与pfu聚合酶中的位置486功能等同的位置处的a486x突变，其中x是除丙氨酸之外的任何氨基酸。终止子的掺入比seq id no:11的突变dna聚合酶高至少2倍(可替代地，4倍或10倍)。

10、作为另一个方面，提供了一种用于3′-oh非模板依赖性寡核苷酸合成的方法。所述方法包括将引发链与3′-oh未修饰的可逆终止子和突变dna聚合酶组合。所述突变dna聚合酶包含：与seq id no:2至少96％相同的氨基酸序列；在与pfu聚合酶中的位置546功能等同的位置处的变为组氨酸的y546h突变；在与pfu聚合酶中的位置409功能等同的位置处的l409y、l409h或l409f突变；以及在与pfu聚合酶中的位置486功能等同的位置处的a486x突变，其中x是除丙氨酸之外的任何氨基酸。所述方法还包括将3′-oh未封闭的未修饰的可逆终止子掺入引发链。

11、结合所附权利要求，从下面的详细描述中，本发明的方法和组合物的这些和其他特征和优点将是清楚的。