一种农药混合污染物神经毒性的检测方法、试剂盒及应用

本发明涉及食品检测领域，具体讲，涉及一种农药混合污染物神经毒性的检测方法、试剂盒及应用。

背景技术：

1、目前，食品的生产与储藏往往需要使用多种杀虫剂、杀菌剂和抗菌用兽药，它们通过多种途径进入到人体，造成潜在的健康危害。目前，我国农药污染对人体健康的影响分析主要是根据单个成分的毒性标准或实验结果。然而，农药的联合暴露对人体产生的危害不同于单独农药引起的危害，混合污染物的交互作用可能产生更为严重的联合毒性效应。美国环境保护署(usepa)和欧盟食品安全局(efsa)近年来均发布了食品、饮用水等途径的有机磷、胺基甲酸酯类及三唑类杀菌剂等的累积性风险评估报告。欧盟法规(ec)396/2005规定在制定农药最大残留限量标准时，应考虑多种农药残留是协同效应，并采用累积性风险评估方法开展多种农药的安全性评价。

2、因此，建立基于毒性联合效应的广谱筛查与监测技术，实现混合污染物联合毒性靶标分子的高效识别，具有重要的迫切的现实意义。

3、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)是目前广泛应用的核酸体外扩增方法，由于该技术依赖热循环步骤，对实验条件和操作人员都有严格要求，不利于实验室外实施。因此，急需构建一种高通量、匹配精准、性能稳定、识别灵敏的筛查手段。

4、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的首要发明目的在于提供一种农药混合污染物神经毒性的检测方法。

2、本发明的第二发明目的在于提供一种农药混合污染物神经毒性的试剂盒。

3、本发明的第三发明目的在于提供gpx4基因和fth1基因在用于检测农药混合污染物神经毒性中的应用。

4、本发明的第四发明目的在于提供铁死亡明星蛋白nrf2、4f2hc、scl7a11、scl11a2、gpx4、fth1在用于检测农药混合污染物神经毒性的应用

5、为了完成本发明的发明目的，采用的技术方案为：

6、本发明提出一种农药混合污染物神经毒性的检测方法，所述农药混合污染为毒死蜱和苯醚甲环唑的混合污染；

7、所述方法包括：检测gpx4基因和fth1基因；

8、优选的，采用等温扩增技术检测gpx4基因和fth1基因。

9、可选的，所述采用等温扩增技术检测gpx4基因和fth1基因的引物如seq id no:1～seq id no:11所示。

10、可选的，所述恒温扩增的反应温度为63～68℃，优选65℃；

11、和/或，所述恒温扩增的反应时间为25～35min，优选30min；

12、和/或，所述恒温扩增反应所用核酸胶的质量百分比浓度为0.8～1.5％，优选为1.2％。

13、可选的，所述检测的待测样本为rna。

14、优选的，所述待测样本中rna的浓度为1～10ng/μl，优选为5ng/μl。

15、本发明涉及一种检测农药混合污染物神经毒性的试剂盒，所述试剂盒包括：恒温扩增试剂、阳性对照样品和阴性对照样品；

16、所述恒温扩增试剂中含有如seq id no:1～seq id no:11所示的引物。

17、可选的，所述恒温扩增试剂中，seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq idno:4、seq id no:5、seq id no:6的摩尔比为1：1：8：8：2：2；seq id no:7、seq id no:8、seqid no:9、seq id no:10、seq id no:11的摩尔比为1：1：8：8：4；

18、优选的，引物的浓度均为100μm，seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq idno:4、seq id no:5、seq id no:6、无菌无酶水的体积比为1：1：8：8：2：2：18；seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、无菌无酶水的体积比为1：1：8：8：4：18。

19、可选的，所述阳性对照样品为毒死蜱、苯醚甲环唑单独及联合暴露于sh-sy5y细胞后的细胞基因组rna，浓度为5ng/μl；

20、所述阴性对照样品为无农药暴露的sh-sy5y细胞基因组rna，浓度为5ng/μl。

21、可选的，述恒温扩增试剂中待测样本的浓度为10～100ng/10μl；优选为50ng/10μl；

22、优选的，恒温扩增试剂的组成为：2.5μl 10倍缓冲液、1.5μl硫酸镁、3.5μl dntp、1μl引物混合物、1μl bst dna聚合酶和16.5μl无菌无酶水。

23、本发明涉及gpx4基因和fth1基因在用于检测农药混合污染物神经毒性的应用。

24、本发明涉及铁死亡明星蛋白nrf2、4f2hc、scl7a11、scl11a2、gpx4、fth1在用于检测农药混合污染物神经毒性的应用。

25、本发明至少具有以下有益的效果：

26、本发明针对混合污染物联合毒性效应与靶标分子不明确的问题，通过建立毒性效应评价细胞模型，利用转录组学测序结合生物信息学获得了明确的多元靶标分子。为了克服pcr技术的缺陷，采用等温扩增技术，对靶标分子进行检测。

27、基于等温扩增技术的食品中农药混合污染检测技术优点是特异性强、灵敏度高且成本低，临床使用不需要特殊仪器；不需要长时间的温度循环,无需pcr等昂贵仪器和实验专员，操作简单，可实现对神经毒性的可视化检测。

技术特征：

1.一种农药混合污染物神经毒性的检测方法，其特征在于，所述农药混合污染为毒死蜱和苯醚甲环唑的混合污染；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用等温扩增技术检测gpx4基因和fth1基因的引物如seq id no:1～seq id no:11所示。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测的待测样本为rna。

5.一种检测农药混合污染物神经毒性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：恒温扩增试剂、阳性对照样品和阴性对照样品；

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述恒温扩增试剂中，seq id no:1、seqid no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6的摩尔比为1：1：8：8：2：2；seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11的摩尔比为1：1：8：8：4；

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照样品为毒死蜱、苯醚甲环唑单独及联合暴露于sh-sy5y细胞后的细胞基因组rna，浓度为5ng/μl；

8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述恒温扩增试剂中待测样本的浓度为10～100ng/10μl；优选为50ng/10μl；

9.gpx4基因和fth1基因在用于检测农药混合污染物神经毒性的应用。

10.铁死亡明星蛋白nrf2、4f2hc、scl7a11、scl11a2、gpx4、fth1在用于检测农药混合污染物神经毒性的应用。

技术总结
本发明涉及食品检测领域，具体讲，涉及一种用于检测食品中农药混合污染的方法、试剂盒及应用。本发明的农药混合污染物神经毒性的检测方法，农药混合污染为毒死蜱和苯醚甲环唑的混合污染；方法包括：检测GPX4基因和FTH1基因；优选采用等温扩增技术检测GPX4基因和FTH1基因。本发明针对混合污染物联合毒性效应与靶标分子不明确的问题，通过建立毒性效应评价细胞模型，利用转录组学测序结合生物信息学获得了明确的多元靶标分子。为了克服PCR技术的缺陷，优选采用等温扩增技术，对靶标分子进行检测。

技术研发人员：房彦军,吴瑾,席令仪,潘志辉,杜连群,孙铁强,孙景然,赵尊全
受保护的技术使用者：军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13