1.本发明涉及基因检测领域，具体地涉及用于二代测序微卫星不稳定位点检测的探针组、系统、检测方法及其应用。
背景技术：
：：2.微卫星不稳定性(microsatelliteinstability,msi)，是指由于在dna复制时插入或缺失突变引起的微卫星(microsatellite,ms)序列长度改变的现象。msi在结直肠癌，在子宫内膜癌、胃癌、肝细胞癌、乳腺癌等实体瘤中均有发生。3.临床研究证实，msi与结直肠癌的预后有着密切的关系。msi-h结直肠癌患者相比mss患者具有显著的生存优势，临床表现较差，但预后更好。研究证实，针对ⅱ/ⅲ期结直肠癌患者，msi-h患者的总生存期及无病生存期明显延长。美国国家综合癌症网络(nationalcomprehensivecancernetwork,nccn)发布的结直肠癌指南，建议msi检测应在所有结直肠癌史的病人中进行。4.目前检测癌细胞中的msi时，既可以通过检测mmr基因缺失来确定是否发生msi，如依赖于免疫组化技术的蛋白水平检测，也可以直接检测msi的序列变化。具体包括：(一)免疫组化方法(immunohistochemistry,ihc)常见的方法为采用免疫组织化学方法检测肿瘤组织中错配修复基因mlh1、msh2、msh6及pms2的表达。此方法检测msi相对较简单，成本较低。但存在一些问题，如使用抗体的不一致、病理医生的阅片标准不一致等。5.(二)分子水平的检测1.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,pcr)技术目前主要采用多重荧光pcr结合毛细管电泳的方法。通过pcr方法检测特异的微卫星重复序列扩增判定msi状态，比较肿瘤患者的标本组织与正常组织的位点突变情况。大量的实验证实，mmr免疫组化检测结果与ms的pcr检测结果有高度关联性，灵敏度92%，特异性可达100%。6.该方法目前是检测msi的方法学“金标准”，但操作过程复杂，花费较高，且在结果判断中会碰到以下问题，如荧光的过强或过少、非特异性峰、不显著的峰大小改变，杂合性缺失等。7.2.新一代测序方法(nextgenerationsequencing,ngs)ngs又称为第二代测序技术，是一种高通量测序技术，能一次性对几十万到几百万条基因分子进行序列测定。目前ngs方法已经成为检测msi的新工具，其最大优势是可以实现多位点高通量检测。实验证明，ngs方法较msi-pcr方法具有更高的敏感性。8.目前仍亟需一种基于第二代测序技术实现微卫星不稳定位点的方便、高效、准确检测的探针组、检测方法及系统。9.
背景技术：
：中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。技术实现要素：10.为解决现有技术中的技术问题，本发明人通过深入研究，设计了针对多达138个msi位点的特异性探针，惊奇地发现与常规野生型探针相比，设计特异性侧翼探针不仅能够有效避开gc异常的区域，而且能够有效弥补孤儿探针的边缘效应所丢失的有效测序读段，进而显著提高msi这种gc异常区域的覆盖度(如图3所示)。此外，本发明独特的探针设计能够大大提高靶点的捕获效率，提高探针的特异性和gc均一性。因此，本发明的探针组、检测方法在癌症相关微卫星检测中具有较高的检测价值以及临床价值和广阔的应用前景。具体地，本发明包括以下内容。11.本发明的第一方面，提供一种用于二代测序微卫星不稳定位点检测的方法，其包括以下步骤：(1)选择至少一个微卫星位点作为靶标；(2)设计针对靶标的探针组，其中，所述探针组包括针对至少一个微卫星位点的侧翼探针，所述侧翼探针覆盖所述至少一个微卫星位点序列的侧翼序列；(3)利用所述探针组捕获目标序列。12.根据本发明所述的用于二代测序微卫星不稳定位点检测的方法，优选地，所述侧翼序列包括微卫星位点序列的5’端序列，且与微卫星位点序列的距离为0-20bp；和/或所述侧翼序列包括微卫星位点序列的3’端序列，且与微卫星位点序列的距离为0-20bp。13.根据本发明所述的用于二代测序微卫星不稳定位点检测的方法，优选地，所述探针组进一步包括野生型探针，所述野生型探针覆盖对应微卫星位点的序列且与之完全匹配。14.根据本发明所述的用于二代测序微卫星不稳定位点检测的方法，优选地，所述探针组进一步包括优化探针，其为当候选侧翼探针在基因组上比对的位置超过20时，在所述候选侧翼探针的基础上向微卫星位点移动从而使探针覆盖微卫星位点中小于10个碱基而形成的探针。15.根据本发明所述的用于二代测序微卫星不稳定位点检测的方法，优选地，针对各微卫星位点的探针由一条野生型探针和两条侧翼探针组成，且两条侧翼探针分别覆盖对应微卫星位点的5’端和3’端之一。16.根据本发明所述的用于二代测序微卫星不稳定位点检测的方法，优选地，进一步包括利用引物对目标序列进行扩增富集的步骤。17.根据本发明所述的用于二代测序微卫星不稳定位点检测的方法，优选地，进一步包括对目标序列进行二代测序的步骤。18.本发明的第二方面，提供用于二代测序微卫星不稳定位点检测的系统，其包括：获取测序数据单元，所述测序数据含有与第一方面所述的微卫星位点对应的测序读段；数据处理单元，所述数据处理单元通过数据处理得到用于微卫星不稳定性多态性分析的有效数据量；微卫星不稳定性多态性分析单元，基于所述有效数据量，确定重复单元的改变，并输出微卫星不稳定性状态；根据本发明所述的系统，优选地，所述重复单元为单碱基重复单元，所述重复单元数为10-30。19.根据本发明所述的系统，优选地，所述改变包括但不限于重复单元的插入和/或缺失。20.本发明的第三方面，提供一种用于二代测序微卫星不稳定位点检测的探针组，所述探针组包括针对至少一个微卫星位点的侧翼探针，所述侧翼探针覆盖所述至少一个微卫星位点序列的侧翼序列。21.根据本发明所述的探针组，优选地，进一步包括针对至少一个微卫星位点的野生型探针，所述野生型探针覆盖至少一个微卫星位点序列且与之完全匹配。22.根据本发明所述的探针组，优选地，所述至少一个微卫星位点选自由表2所示的微卫星位点组成的组。23.本发明的第四方面，提供一种用于二代测序微卫星不稳定位点检测的试剂盒，其包括根据第三方面所述的探针组和说明书，其中，所述说明书包括如何使用所述探针组进行微卫星不稳定位点的检测以及微卫星不稳定的判断标准。24.本发明的第五方面，提供根据第三方面所述的探针组或根据第四方面所述的试剂盒在癌症相关的微卫星不稳定位点检测中的用途，所述癌症包括但不限于胃癌、结直肠癌、食管癌、子宫内膜癌、肝细胞癌、乳腺癌或卵巢癌。25.本发明以138个msi位点为中心，分别设计野生型探针以及野生型探针+侧翼探针，对捕获后的有效覆盖深度进行比较，发现野生型探针+侧翼探针比单纯野生型探针能显著提高覆盖深度，达到基本与非gc异常区域平均深度接近的水平。26.进一步的，本发明比较了野生型探针+侧翼探针，和单独侧翼探针捕获后的整体捕获效率、msi区域的覆盖深度，发现单独侧翼探针在覆盖深度上与野生型探针+侧翼探针相比，不仅探针的捕获效率有显著提升，同时msi区域的覆盖深度也有显著提升。考虑到由于野生型探针完全覆盖了at重复区域，其探针特异性比较差，gc也有偏离，会增加杂交捕获的脱靶率，而改由单独的侧翼探针进行捕获，提高了探针的特异性和gc均一性。附图说明27.图1示例性示出了msi位点的靶标序列。28.图2示出了侧翼探针和优化探针的关系。29.图3为侧翼探针和野生型探针能够提高msi区域的覆盖度的结果示意图。30.图4示出了侧翼探针提高对msi区域覆盖深度。31.图5示出了单独侧翼探针比野生型探针+侧翼探针能够显著性提升msi位点的覆盖深度。32.图6示出了单独侧翼探针比野生型探针+侧翼探针能够显著性提升捕获效率。具体实施方式33.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。34.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。35.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。36.除非另有说明，本文所用术语“检测”是指包括确定样品中的微卫星不稳定位点的存在与否和/或定性微卫星不稳定位点的类型的方法。37.本发明中，微卫星位点来源于待测样本，术语“待测样本”是指来源于受试者/患者的生物样品。可用于本发明的生物样品类型的实例包括但不限于以下的一种或多种：尿、粪便、泪液、全血、血清、血浆、血液成分、骨髓、细胞、组织、器官、体液、唾液、脸颊拭子、淋巴液、脑脊髓液、病变渗出物和由身体产生的其他流体。生物样品类型也可以是冷冻、固定、石蜡包埋或新鲜的活检样品。38.本文所用术语“受试者”是指脊椎动物，优选为哺乳动物，还优选为人。哺乳动物包括但不限于鼠类、猿、家畜等。具体的哺乳动物包括大鼠、小鼠、猫、狗、猴子和人。非人类哺乳动物包括除人之外的所有哺乳动物。在体外获得或在体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代也涵盖在本发明的保护范围之内。39.除非另有说明，本文所述检测方法、系统、探针组，基于探针组的试剂盒等对二代测序微卫星不稳定检测具有优异的技术效果，下面进行详细说明。40.二代测序微卫星不稳定位点检测的方法本发明的第一方面，提供一种用于二代测序微卫星不稳定位点检测的方法，其包括以下步骤：(1)选择至少一个微卫星位点作为靶标；(2)设计针对靶标的探针组，其中，所述探针组包括针对至少一个微卫星位点的侧翼探针，所述侧翼探针覆盖所述至少一个微卫星位点序列的侧翼序列；(3)利用所述探针组捕获目标序列。41.本发明中的方法步骤(1)中，所选择的msi位点特别指那些涉及单核苷酸重复的位点，例如含有单碱基a或t的重复。此外，本发明人通过研究发现，重复次数，即重复单元的长度不同影响探针组对上述位点的区分度。优选地，重复次数为10-50次，还优选为10-30次，进一步优选为15-25次。这里所述的重复次数是指重复单元在稳定时的重复次数。在具体实施方案中，本发明的微卫星位点的具体信息如表2所示，其中，基因组的位置是从基因组数据库hg19版本所确定。42.本发明中的方法步骤(2)中，所述探针优选地为dna探针或rna探针。目前，探针设计的思路仍基于所要检测msi区间的序列进行，因此并没有针对msi位点的侧翼设计的探针或探针组。现有探针设计覆盖msi多个重复区域，一方面导致捕获效率低，目标覆盖度差。另一方面，还会导致捕获基因组的其他非目的区域片段。在杂交捕获过程中，这样的区域由于at含量高，探针和目标区域结合效率差(如图1所示）；同时由于文库片段是随机分布的，单独一条探针与目的片段的捕获率会随着结合长度的减少而降低，最终导致这些区域的有效测序读段数很少，无法得到有效的、正确的判读结果。含有简单重复序列的探针，在整体捕获特异性方面也受到显著影响，导致整体捕获效率偏低，目标覆盖度差。43.本发明的探针组含有针对微卫星位点的侧翼序列设计的探针。优选地，所述侧翼序列包括微卫星位点序列的5’端序列，且与微卫星位点序列的距离为0-20bp，还优选为0-10bp，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10bp；和/或所述侧翼序列包括微卫星位点序列的3’端序列，且与微卫星位点序列的距离为0-20bp，还优选为0-10bp，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10bp。44.在本发明的步骤(3)中，利用碱基互补配对原理，将上述设计好的探针组中的探针与目标区域结合后，进一步对目标区域进行二代测序。用于二代测序的系统或平台不特别限定，其包括但不限于大规模平行签名测序(massivelyparallelsignaturesequencing，mpss)、聚合酶克隆(polonysequencing)、454焦磷酸测序(454pyrosequencing)、illumina(solexa)sequencing、abisolidsequencing、离子半导体测序(ionsemiconductorsequencing)、dna纳米球测序(dnananoballsequencing)等。45.在具体实施方案中，将探针组与磁珠混合并吸附后，通过洗脱处理得到目标基因片段。例如，可以先将本发明提供的探针组中的各个探针进行生物素标记，然后在杂交后用链霉亲和素磁珠吸附杂交产物，通过探针上的生物素和链霉亲和素的结合被吸附到磁珠上，再从磁珠上释放出富集的微卫星不稳定相关微卫星位点片段。46.在具体实施方案中，将洗脱处理得到的目标基因片段利用pcr进行片段扩增，取长度在220-320bp之间的扩增片段进行二代测序并分析，得到微卫星不稳定结果。47.本发明中，msi状态为高、低、或稳定，其状态包括微卫星高度不稳定(microsatelliteinstability-high,msi-h)、微卫星低度不稳定(microsatelliteinstability-low,msi-l)和微卫星稳定(microsatellitestable，mss)型。48.探针组本发明的探针组包括针对至少一个微卫星位点的侧翼探针，所述侧翼探针覆盖所述至少一个微卫星位点序列的侧翼序列。优选地，探针组进一步包括针对至少一个微卫星位点的野生型探针，进一步优选地，探针组包括优化探针。此处的侧翼序列已进行了详细说明，在此不再赘述。下面详细说明野生型探针和优化探针。49.本发明的野生型探针是指覆盖至少一个微卫星位点的全部序列且与之完全匹配的探针。在进行探针设计时，如果候选探针的特异性较差，例如当将120个碱基长度的探针与基因组上进行比对，若其中100个碱基在基因组上比对的位置超过20，则定义该探针的特异性较差，不易将其作为探针。优选地，选择比对位置≤20的探针作为候选探针。50.在探针设计时，需考虑侧翼探针的位置，优选地候选侧翼探针的位置紧邻微卫星位点，比如左侧(5’端)的侧翼探针的3’端紧邻微卫星序列的5’端。当紧邻侧翼探针的特异性差(例如＞20时)，则向微卫星靶标的外侧(5’方向)挪动1-20个碱基。或者向内侧(3’方向)挪动10个碱基，此时的探针为优化探针。本发明的优化探针是为避免例如探针特异性差而优化后的探针。此类探针是可选的探针，即使在包含此类探针时，其也不是探针组中的主要探针。关于侧翼探针、优化探针的关系参见图2。51.可以理解的是，本发明的探针组可以仅含有针对至少一个微卫星位点的一个侧翼序列的侧翼探针，即该侧翼探针仅覆盖至少一个微卫星位点序列的5’端序列或3’端序列。本发明的探针组也可以含有针对至少一个微卫星位点的两侧的侧翼序列的侧翼探针。此时，侧翼探针可以例如由两个侧翼探针组成，其分别覆盖至少一个微卫星位点序列的5’端序列和3’端序列。侧翼序列与微卫星位点序列的距离为0-20bp。52.在本发明中，对具体探针序列不特别限定，虽然本发明中没有示出具体的探针序列，但是本领域技术人员能够根据本发明所列出的msi位点(参见表2)和探针设计思路得到所需侧翼探针和/或野生型探针，并进一步组成探针组。53.试剂盒本发明进一步提供试剂盒，其包含特异性检测微卫星不稳定位点的试剂，所述试剂包括本发明的探针组。本发明的试剂盒进一步包括关于如何对特定的生物样品类型进行本发明的检测方法或试验的说明和msi判断标准。该试剂盒可进一步包含能够通过各种测定类型(诸如elisa测定、免疫测定、蛋白质芯片或微阵列、dna/rna芯片或微阵列、rt-pcr、二代或三代测序、质谱法、免疫组织化学法、流式细胞术或高含量细胞筛选)进行常规检测的其他试剂。54.除了上述组分之外，本发明的试剂盒还可包括以政府机构规定的形式与调控制造、使用或销售诊断试剂盒相关的注意事项。另外，本发明的试剂盒还可提供有使用、储存和故障排除的详细说明书。试剂盒还可任选地设置在适合的优选用于以高通量设置的机器人操作的装置中。55.在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分(例如，寡核苷酸)可提供为干粉。当试剂和/或组分提供为干粉时，粉末可通过添加适合的溶剂来恢复原状。预期该溶剂还可设置于另一容器中。容器通常会包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器和/或其它容器手段，其中可选等分地放置溶剂。试剂盒还可包括用于包含无菌、药学上可接受的缓冲液和/或其它溶剂的第二容器的手段。56.在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分可以溶液形式提供，例如水溶液的形式提供。在以水溶液状态存在的情况下，这些成分的浓度或含量是本领域技术人员能够根据不同需求而方便地确定的。例如，用于储存的目的时，例如寡核苷酸的浓度可以较高的形式存在，当处于工作状态或使用时，可通过例如稀释上述较高浓度的溶液来将浓度降低至工作浓度。57.在试剂盒中存在超过一种组分的情况下，该试剂盒还通常会包含可单独放置另外的组分的第二、第三或其它另外的容器。另外，可在容器中包含各多种组分的组合。本文所述的任何组合物或试剂可为试剂盒中的组分。58.系统本发明的用于二代测序微卫星不稳定位点检测的系统包括：获取测序数据单元，所述测序数据含有与本发明所述的微卫星位点对应的测序读段；数据处理单元，所述数据处理单元通过数据处理得到用于微卫星不稳定性多态性分析的有效数据；微卫星不稳定性多态性分析单元，基于所述有效数据，确定重复单元的改变，并输出微卫星不稳定性状态。59.数据处理步骤不特别限定，只能能够实现测序的数据质控即可。测序获得的数据，使用常用生物信息学分析软件比对至人类参考基因组grch3/hg19(可从ucsc网站http://genome.ucsc.edu下载)，经过适当处理，使用常用生物信息学分析软件找出每个微卫星位点不同重复元素的测序片段数。其结果即可作为本发明提出的分析流程的输入信号进行msi状态分析，确认微卫星位点的稳定性及样本的微卫星稳定状态。60.本领域的技术人员可以理解的是，本发明所述的各种示例性实施方案可以通过软件实现，也可以通过软件结合必要的硬件的方式来实现。因此，根据本发明的具体实施方案可以以软件产品的形式体现出来，该软件产品可以存储在一个非易失性存储介质或非暂态计算机可读存储介质(可以是cd-rom、u盘、移动硬盘等)中或网络上，包括若干指令以使得计算设备(可以是个人计算机、服务器、移动终端、或者网络设备等)执行根据本发明的方法。61.在示例性实施方案中，本发明的程序产品可以采用一个或多个可读介质的任意组合。可读介质可以是可读信号介质或者可读存储介质。可读存储介质例如可以为但不限于电、磁、光、电磁、红外线或半导体的系统、装置或器件，或者任意以上的组合。可读存储介质的更具体的实例包括但不限于：具有一个或多个导线的电连接、便携式盘、硬盘、随机存取存储器(ram)、只读存储器(rom)、可擦式可编程只读存储器(eprom或闪存)、光纤、便携式紧凑盘只读存储器(cd-rom)、光存储器件、磁存储器件、或者上述的任意合适的组合。62.相应地，基于同一发明构思，本发明还提供一种电子设备。63.在示例性实施方案中，电子设备以通用计算设备的形式表现。电子设备的组件可以包括但不限于：至少一个处理器、至少一个存储器、连接不同系统组件(包括存储器和处理器)的总线。64.其中，所述存储器存储有程序代码，所述程序代码可以被所述处理单元执行，使得所述处理单元执行本发明所述的方法，其中处理器至少包括本发明所述的数据处理单元(也可以称为“模块”)。存储器可以包括易失性存储单元形式的可读介质，例如随机存取存储单元(ram)和/或高速缓存存储单元，还可以进一步包括只读存储单元(rom)。65.本发明的存储器还可以包括具有一组(至少一个)程序模块的程序/实用工具，这样的程序模块包括但不限于：操作系统、一个或者多个应用程序、其它程序模块以及程序数据，这些示例中的每一个或某种组合中可能包括网络环境的实现。66.总线可以为表示几类总线结构中的一种或多种，包括存储器总线或者存储器控制器、外围总线、图形加速端口、处理单元或者使用多种总线结构中的任意总线结构的局域总线。67.电子设备也可以与一个或多个外部设备(例如键盘、指向设备、蓝牙设备等)通信，还可与一个或者多个使得用户能与该电子设备交互的设备通信，和/或与使得该电子设备能与一个或多个其它计算设备进行通信的任何设备(例如路由器、调制解调器等等)通信。68.这种通信可以通过输入/输出(i/o)接口进行。并且，电子设备还可以通过网络适配器与一个或者多个网络(例如局域网(lan)，广域网(wan)和/或公共网络，例如因特网)通信。网络适配器通过总线与电子设备的其它模块通信。应当明白，尽管本文未示出，可以结合电子设备使用其它硬件和/或软件模块，包括但不限于：微代码、设备驱动器、冗余处理单元、外部磁盘驱动阵列、raid系统、磁带驱动器以及数据备份存储系统等。69.本发明的系统或方法的检测/鉴别价值可通过例如计算受试者工作特征曲线下面积(auc)、灵敏度、特异度等评价指标来判断其效能。其中auc也称为受试者工作特征曲线下面积，其被定义为roc曲线下与坐标轴围成的面积，所述面积的数值范围在0.5和1之间。auc越接近1.0，检测方法真实性越高。70.用途本发明提供探针组或试剂盒在癌症相关的微卫星不稳定位点检测中的用途，其中，所述癌症包括但不限于胃癌、结直肠癌、食管癌、子宫内膜癌、肝细胞癌、乳腺癌和卵巢癌。71.本领域技术人员应理解，只要能够实现本发明的目的，在上述步骤(1)-(3)前后，或步骤之间还可包含其他步骤或操作，例如进一步优化和/或改善本发明所述的方法。72.实施例11、杂交前文库构建1)取dna200ng，使用covarism220对dna进行打断。73.2)使用abclonal公司的rapiddnalibprepkit进行核苷酸文库构建：包括末端修复、接头连接、文库富集等步骤。74.3)将核苷酸文库使用agencourtampurexp磁珠纯化后，使用qubit4.0以及agilent2100毛细管电泳进行质控。75.2、探针杂交捕获1)探针设计在本实施例中，示例性的示出了5个msi位点bat-25、bat-26、nr-21、nr-24和nr-27为中心分别设计的野生型探针以及侧翼探针(探针序列见表1)。76.表1下表示出了138个msi位点和相应的探针设计区域。77.表22)文库杂交捕获将500ng制备好的杂交前文库与人cot-1dna、文库封闭试剂混合，使用真空抽滤泵45℃蒸干后，再复溶于杂交液中，室温孵育10min后上pcr仪，95℃、5min后加入混合好的探针，再置于65℃杂交16-18h。78.3)链霉亲和素磁珠吸附与清洗将步骤2)产物与链霉亲和素磁珠混合，在pcr仪上孵育45min，后续用清洗液对磁珠进行清洗。79.4)探针捕获区域富集使用引物、高保真聚合酶等对步骤3)产物进行富集，经过agencourtampurexp磁珠纯化后使用qubit4.0以及agilent2100毛细管电泳进行质控。80.5)上机测序。81.3、结果通过对下机数据分析发现，在5个msi位点的覆盖深度上，野生型探针+侧翼探针比单纯野生型探针能显著性提升覆盖深度，最高能整体提升5倍以上覆盖度。同时在msi位点两侧无法同时覆盖侧翼探针，只能覆盖单边的侧翼探针时（nr24marker），相比较单纯野生型探针依然可以有效提升msi位点的覆盖深度(如图4所示)。野生型探针+侧翼探针的覆盖深度可达到基本与非gc偏离区域深度接近的水平。保证了有效数据量，实现更准确的msi的多态性分析。82.实施例21、36例样本杂交前文库构建1)取dna200ng，使用covarism220对dna进行打断。83.2)使用abclonal公司的rapiddnalibprepkit进行核苷酸文库构建：包括末端修复、接头连接、文库富集等步骤。84.3)将核苷酸文库使用agencourtampurexp磁珠纯化后，使用qubit4.0以及agilent2100毛细管电泳进行质控。85.2、36例样本单独侧翼探针杂交捕获与野生型+侧翼探针杂交捕获1)文库杂交捕获将500ng制备好的杂交前文库与人cot-1dna、文库封闭试剂混合，使用真空抽滤泵45℃蒸干后，再复溶于杂交液中，室温孵育10min后上pcr仪，95℃、5min后加入混合好的探针，再置于65℃杂交16-18h。86.2)链霉亲和素磁珠吸附与清洗将步骤1)产物与链霉亲和素磁珠混合，在pcr仪上孵育45min，后续用清洗液对磁珠进行清洗。87.3)探针捕获区域富集使用引物、高保真聚合酶等对步骤3)产物进行富集，经过agencourtampurexp磁珠纯化后使用qubit4.0以及agilent2100毛细管电泳进行质控。88.4)上机测序。89.3、结果36例样本在杂交捕获前文库产量、使用野生型探针+侧翼探针杂交捕获以及单独侧翼探针杂交后文库产量如表3所示。90.表336例样本的msi判读结果准确性和一致性见表4。91.表436例样本的单独侧翼探针杂交捕获结果与野生型+侧翼探针杂交捕获结果见表5。92.表5通过36对样本下机数据分析发现：(1)在msi的结果判读上，不管是单独侧翼探针还是野生型探针+侧翼探针，其结果都和一代金标准的判读结果一致性100%，5例msi-h以及31例mss样本均判读准确。93.(2)在msi位点的覆盖深度上，单独侧翼探针比野生型探针+侧翼探针能显著性提升覆盖深度(见图5)，且两者的覆盖深度均可达到基本与非gc偏离区域深度接近的水平。保证了有效数据量，实现更准确的msi的多态性分析。94.(3)在panel的整体捕获效率上，单独侧翼探针比野生型探针+侧翼探针能显著性提升捕获效率(见图6)。95.尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。当前第1页12当前第1页12