青梅酵素中二氨基柠檬酸的分离方法及应用

1.本发明涉及青梅酵素中二氨基柠檬酸的分离方法及应用，属于化学医药技术领域。


背景技术：

2.青梅(prunusmume sieb.et zucc.)是蔷薇科李属植物，主要分布于长江流域及华南、西南地区一带。青梅果实不仅营养丰富，还具有许多保健功能，青梅果汁经天然或人工发酵可以产生酵素，青梅酵素能提高免疫力人；促进人体肠道运动，可改善便秘；改善牙龈炎，缓解牙龈肿痛；改善睡眠质量；酒前服用可预防醉酒；有祛斑的功效色，使皮肤细腻，面色红润。
3.目前已知青梅酵素含有丰富的sod(超氧化物歧化酶)，具有延缓人体衰老，消除局部炎症等方面，有关青梅酵素中的其他功效成分还不清楚。
4.我们采用植物乳杆菌作为发酵菌，将青梅汁分期逐渐加入发酵液中最终获得高产sod青梅酵素。本发明从青梅酵素中提取分离到一种二氨基柠檬酸，发现其能促进人体内乙醇的分解，具有预防醉酒和解酒的功效。


技术实现要素：

5.本发明首次从青梅酵素中提取分离到一种二氨基柠檬酸，是一种新的氨基酸，并确定该化合物为青梅酵素中解酒的主要功效成分。
6.本发明的第一个目的是提供一种分离制备二氨基柠檬酸的方法包括以下步骤：
7.(1)提取：将青梅酵素过滤，取清液，减压浓缩到20-25％体积即得青梅酵素浓缩物。
8.(2)分离：将步骤(1)所得青梅酵素浓缩物进行柱层析，用水和不同浓度乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得到二氨基柠檬酸。
9.在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中青梅酵素的制备过程包括：
10.青梅经过压榨、过滤，获得青梅压榨汁；将蔗糖加入到青梅压榨汁中，混匀获得青梅汁糖液；然后加入大豆蛋白粉，活化的植物乳杆菌进行发酵，发酵结束后，得到青梅酵素。
11.在本发明的一种实施方式中，蔗糖与青梅压榨汁的质量比为1:2。
12.在本发明的一种实施方式中，大豆蛋白粉与青梅汁糖液的的质量比为1:18。
13.在本发明的一种实施方式中，植物乳杆菌的酶活为100亿cfu/g，植物乳杆菌相对青梅汁糖液的质量分数为2％-3％。
14.在本发明的一种实施方式中，发酵是指在30
±
2℃下发酵30日，然后温度降至20
±
2℃，继续发酵30日。
15.在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)包括如下过程：
16.将青梅酵素浓缩物上mci层析柱，先用去离子水、再用体积分数为5％的乙醇进行梯度洗脱，每梯度洗脱2个柱体积，收集5％的乙醇洗脱部分；减压浓缩后上样到ods-aq层析
柱，用1个柱体积的去离子水洗、然后用2个柱体积的体积分数为10％的乙醇洗脱，收集10％乙醇洗脱部分；浓缩后再上hw-40柱，用2个柱体积的去离子水洗脱，收集水洗脱液，浓缩干燥，即得二氨基柠檬酸产物。
17.本发明的第二个目的是提供如下结构所示的二氨基柠檬酸化合物：
[0018][0019]
本发明的第三个目的是提供上述二氨基柠檬酸在制备预防醉酒或者解酒药物中的应用，但不包括疾病的诊断和治疗方法。
附图说明
[0020]
图1为二氨基柠檬酸的1h-nmr图；
[0021]
图2为二氨基柠檬酸的
13
c-nmr图；
[0022]
图3为二氨基柠檬酸的
135
dept-nmr图。
具体实施方式
[0023]
实施例1：分离制备二氨基柠檬酸
[0024]
青梅酵素的获取：
[0025]
青梅清洗、压榨、过滤，得到青梅压榨汁；取12kg过滤好的青梅压榨汁加入6kg蔗糖，充分溶解得到青梅汁糖液18kg，加入大豆蛋白粉(购于武汉秉和食品配料有限公司生产)1.0kg，搅拌均匀后再加入活化的植物乳杆菌(酶活为100亿cfu/g，购于山东中科嘉亿生物工程公司，批号20210417)0.38kg，控制温度30
±
2℃，发酵30日；将发酵温度降至20
±
2℃，继续发酵30日结束，即得青梅酵素。
[0026]
从青梅酵素中提取纯化二氨基柠檬酸方法，其步骤如下：
[0027]
将青梅酵素过滤，取清液，减压浓缩到20％体积，即得青梅酵素浓缩物。
[0028]
将青梅酵素浓缩物上mci层析柱，先用去离子水、再用体积分数为5％的乙醇进行梯度洗脱，每梯度洗脱2个柱体积，收集5％的乙醇洗脱部分；减压浓缩后上样到ods-aq层析柱，用1个柱体积的去离子水洗、然后用2个柱体积的体积分数为10％的乙醇洗脱，收集10％乙醇洗脱部分；浓缩后再上hw-40柱，用2个柱体积的去离子水洗脱，收集水洗脱液，浓缩干燥，最后得一个单体化合物产物——二氨基柠檬酸，该化合物产物为无色块状结晶。
[0029]
利用hplc测定所得的二氨基柠檬酸的收率为89.34％，纯度为98.47％。
[0030]
利用核磁共振对所得产物的结构进行鉴定：
[0031]1h-nmr(500mhz，d2o)δ2.67(1h,d,j＝15.1),2.49(1h,d,j＝16.0).
[0032]
13
c-nmr(500mhz，d2o)δ179.1,175.8,75.7,45.7.
[0033]
相应归属信息见表1。
[0034][0035]
表1 产物二氨基柠檬酸的1h和
13
c核磁共振数据
[0036][0037]
化合物为无色块状结晶，易溶于水，可溶于甲醇、乙醇。esi-ms m/z＝222.4[m]
+
。
[0038]1h-nmr中有δ2.68(1h，d,j＝15.1)，δ2.50(1h，d,j＝16.0)二个h信号，这二个h的偶合常数不同，说明二者并无相关，其偶合是由其他氢信号引起。
13
c-nmr呈现4组碳信号，其中δ175.8，45.7碳信号从丰度来看，每组应为2个碳，同时得出化合物具有对称性，从碳的化学位移看应为3个羧基，δ75.8为连氧碳。从这些数据可以得出化合物符合柠檬酸类结构，
135
dept谱中只有δ45.7出现1组-ch-碳信号，而柠檬酸应为2个-ch
2-碳信号，这表明柠檬酸的c2,c5位上还有取代基，这二个取代基为非碳类基团，从化学位移看只能-nh2，刚好与分子量也吻合。综上所述该化合物为二氨基柠檬酸，这是一个新的化合物。
[0039]
实施例2：化合物二氨基柠檬酸的用途
[0040]
利用动物实验对二氨基柠檬酸解酒功效进行检测，购入四周龄spf级雄性icr小白鼠50只，体重16.0
±
2.0g，随机分组，每组10只，分为空白对照组(k)、二氨基柠檬酸低剂量组(100mg/kg)、中剂量组(250mg/kg)、高剂量组(500mg/kg)。适应性喂养一周后，空白对照组灌胃1g/kg/d生理盐水，各实验组灌胃相应剂量的二氨基柠檬酸，连续7d，在第7d给药30min后，各组灌胃同等剂量的45度白酒。各小组小鼠在末次给药30min后给酒，立即计时，观察并记录各组小鼠行为，记录其醉酒和醒酒时间，计算醉酒潜伏期(自灌胃白酒至翻正反射消失时间)及醉睡时间(自翻正反射消失至恢复时间)，记录醉酒动物数；翻正反射消失时间以小鼠背部向下保持30s为标准；当小鼠活动自如，精神，灵活，即为翻正反射恢复。
[0041]
表2 二氨基柠檬酸剂量对解酒指标的影响
[0042]
[0043]
注：“*”表示p＜0.05；“**”表示p＜0.01。
[0044]
可以得出二氨基柠檬酸低、中、高剂量都有明显抗醉酒活性，并具有解酒作用。