氧甲基转移酶Cy6OMT及其在催化苄基异喹啉生物碱中的应用

本发明涉及生物，具体涉及氧甲基转移酶cy6omt及其在催化苄基异喹啉生物碱化合物中的应用。

背景技术：

1、中药延胡索是罂粟科紫堇属延胡索corydalis yanhusuo的干燥块茎，具有活血、行气、止痛的功效，用于治疗胸胁、脘腹疼痛，胸痹心痛，经闭痛经，产后瘀阻，跌扑肿痛4。延胡索的主要成分为苄基异喹啉类生物碱，其中延胡索乙素，延胡索甲素和延胡索丑素被认为是延胡索的主要止痛成分。近年来，越来越多的药理证据显示出原小檗碱型化合物具有开发为非成瘾性止痛药物的潜力以及治疗物质使用障碍(substance use disorders)的潜力，如缓解使用吗啡类药物引发的成瘾综合征等。因此,传统中药延胡索是一个极具前景的止痛药物的资源库，值得我们进一步的开发。

2、苄基异喹啉生物碱(bia)是一类重要的次生代谢物，主要分布于罂粟科、毛茛科、小檗科和防己科植物。目前已报道的bia大约有2,500种，包括麻醉镇痛药可待因(codeine)和吗啡(morphine)，镇痛药延胡索乙素(tetrahydropalmatine)，抗菌药血根碱(sanguinarine)和小檗碱(berberine chloride hydrate)等。异喹啉类生物碱活性与立体结构严格相关，对于结构复杂的bias类化合物，提取纯化和化学合成都有很大局限，因此次生代谢物的合成生物学研究即利用分子生物学技术和代谢工程手段构建高产的基因工程菌的方法受到广泛关注。近些年bias的微生物代谢工程研究取得了许多突破性的进展,在微生物中已构建出蒂巴因、氢可待因、诺斯卡品、延胡索乙素等生物碱的完整通路，极大促进苄基异喹啉类化合物的异源生产。少数植物物种被视为研究bia生物合成途径的模型系统，除模式植物外，还有许多在传统医学中历史悠久的含bias的植物也同样具有研究开发的潜力。

3、延胡索的主要成分是小檗碱型和原小檗碱型化合物，生物合成途径主体较为清晰：去甲乌药碱合酶ncs通过催化多巴胺和4-hpaa两分子间形成c-c键生成(s)-norcoclaurine，再经过3个甲基转移酶(6omt,cnmt,4’omt)以及一个p450酶nmch生成重要中间体(s)-reticuline，它是吗啡类、原小檗碱类和苯骈菲啶类化合物重要的共同中间体。在原小檗碱途径上，bbe催化(s)-reticuline形成(s)-scoulerine,接着甲基转移酶somt、coomt进一步催化(s)-scoulerine形成延胡索乙素。原小檗碱型化合物如延胡索乙素在stox酶作用下氧化成小檗碱型化合物。

4、6omt催化(s)-norcoclaurine甲基化生成(s)-coclaurine，被认为是bia途径中的限速酶，在e.californica细胞中过表达coptis japonica 6omt及在opium poppy中过表达6omt都显著提升细胞中总生物碱的积累。分离鉴定的6omt主要来自papaver somniferum、glaucium flavum、thalictrum flavum、coptis japonica、c.chinensis、c.teeta和stephania tetrandra。在体外功能验证中，cj6omt(coptis japonica来源的6omt)具有较高的专一性，具有甲基化1-bia类化合物c6位羟基的功能，但不能高效催化原小檗碱型化合物。cc6omt(c.chinensis来源的6omt)催化(s)-norcoclaurine c6位羟基甲基化功能，并伴随少量c7位羟基甲基化产物。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何获得能够催化1-bia化合物(s)-norcoclaurine的c6位羟基甲基化，并同时对(原)小檗碱型化合物的异喹啉结构的羟基具有催化功能的氧甲基转移酶。

2、为了解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质相关的生物材料。所述蛋白质可为如下a1)、a2)、a3)或a4)的蛋白质：

3、a1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质。

4、a2)氨基酸序列是序列表中序列1的第166-513位的蛋白质。

5、a3)在a1)或a2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白。

6、a4)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由a1)或a2)衍生的或与a1)或a2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质。所述生物材料可为下述b1)至b6)中的任一种：

7、b1)编码所述蛋白质的核酸分子。

8、b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒。

9、b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体。

10、b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物。

11、b5)促进或提高所述蛋白质表达的核酸分子。

12、b6)含有b5)所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

13、上文所述的生物材料中，b1)所述核酸分子可为如下b1)、b2)或b3)所示的所述蛋白质的编码基因：

14、b1)编码序列是序列表中序列2的第496-1542位核苷酸的cdna分子或dna分子。

15、b2)核苷酸是序列表中序列2的cdna分子或dna分子。

16、b3)与b2)限定的cdna或dna分子杂交且编码具有相同功能的蛋白质的cdna分子或dna分子。

17、上文所述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

18、上文所述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。

19、上文所述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

20、上文所述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、85％、86％、88％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

21、上文所述杂交可为在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

22、上述生物材料中，b2)所述的含有核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达上文所述蛋白质的dna。所述表达盒还可包括表达上述任意一种蛋白的核酸分子所必需的所有调控序列的单链或双链核酸分子。所述调控序列在其相容条件下能指导编码序列在合适的宿主细胞中表达上述任一种蛋白质。所述调控序列包括，但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。最低限度，调控序列要包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了导入载体的特定限制性酶位点以便将调控序列与编码蛋白质的核酸序列的编码区进行连接，可以提供带接头的调控序列。调控序列可以是合适的启动子序列，即可被表达核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。启动子序列含有介导蛋白质表达的转录调控序列。启动子可以是在所选宿主细胞中有转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，可以得自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内蛋白质的基因。调控序列还可以是合适的转录终止序列，即能被宿主细胞识别从而终止转录的一段序列。终止序列可操作连接在编码蛋白质的核酸序列的3’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何终止子都可以用于本发明。调控序列还可以是合适的前导序列，即对宿主细胞的翻译十分重要的mrna非翻译区。前导序列可操作连接于编码蛋白质的核酸序列的5’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何前导序列均可用于本发明。调控序列还可以是信号肽编码区，该区编码一段连在蛋白质氨基端的氨基酸序列，能引导编码蛋白质进入细胞分泌途径。能引导表达后的蛋白质进入所用宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区都可以用于本发明。添加能根据宿主细胞的生长情况来调节蛋白质表达的调控序列可能也是需要的。调控系统的例子是那些能对化学或物理刺激物(包括在有调控化合物的情况下)作出反应，从而开放或关闭基因表达的系统。调控序列的其他例子是那些能使基因扩增的调控序列。在这些例子中，应将编码蛋白质的核酸序列与调控序列可操作连接在一起。

23、为了解决上述技术问题，本发明还提供了蛋白质作为氧甲基转移酶在制备苄基异喹啉(类)生物碱中的应用，所述蛋白质可为上文所述的蛋白质。

24、上文所述的蛋白质也属于本发明的保护范围。

25、为了解决上述技术问题，本发明还提供了蛋白质在作为氧甲基转移酶或在制备苄基异喹啉(类)生物碱中的应用。所述蛋白质可为上文所述的蛋白质。

26、所述苄基异喹啉(类)生物碱可为(s)-乌药碱、四氢巴马汀和/或巴马汀。

27、为了解决上述技术问题，本发明还提供了上文所述的生物材料和/或上文所述的蛋白质的下述任一种应用：

28、f1、上文所述的生物材料和/或上文所述的蛋白质在催化(s)-去甲乌药碱(s)-norcoclaurine的c6位羟基甲基化中的应用。

29、f2、上文所述的生物材料和/或上文所述的蛋白质在催化非洲防己碱(columbamine)c2位羟基(即异喹啉结构的c7位羟基)甲基化中的应用。

30、f3、上文所述的生物材料和/或上文所述的蛋白质在催化药根碱(jatrorrhizine)c3位羟基甲基化中的应用。

31、f4、上文所述的生物材料和/或上文所述的蛋白质在催化四氢药根碱(tetrahyjatrorrhizine)c3位羟基(即异喹啉结构的c6位羟基)甲基化中的应用。

32、f5、上文所述的生物材料和/或上文所述的蛋白质在制备苄基异喹啉(类)生物碱中的应用。

33、f6、上文所述的生物材料和/或上文所述的蛋白质在制备苄基异喹啉(类)生物碱产品中的应用。

34、上文所述的生物材料和/或上文所述的蛋白质相关的下述任一种产品也属于本发明的保护范围：

35、p1、生产苄基异喹啉(类)生物碱的产品。

36、p2、制备催化(s)-去甲乌药碱(s)-norcoclaurine的c6位羟基甲基化的产品。

37、p3、制备催化非洲防己碱(columbamine)c2位羟基(即异喹啉结构的c7位羟基)甲基化的产品。

38、p4、制备催化药根碱(jatrorrhizine)c3位羟基(即异喹啉结构的c6位羟基)甲基化的产品。

39、p5、制备催化四氢药根碱(tetrahyjatrorrhizine)c3位羟基(即异喹啉结构的c6位羟基)甲基化的产品。

40、p6、生产延胡索来源的(s)-norcoclaurine 6位氧甲基转移酶cy6omt的产品。

41、上文所述的产品中，所述苄基异喹啉(类)生物碱可为(s)-乌药碱、四氢巴马汀和/或巴马汀。

42、为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种制备延胡索来源的(s)-norcoclaurine6位氧甲基转移酶cy6omt的方法。所述方法包括如下步骤：将上文所述蛋白质的编码基因在原核微生物中进行表达得到所述延胡索来源的(s)-norcoclaurine 6位氧甲基转移酶cy6omt。

43、上文所述方法中，将所述蛋白质的编码基因在原核微生物中进行表达可包括将上文所述蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述延胡索来源的(s)-norcoclaurine 6位氧甲基转移酶cy6omt的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述延胡索来源的(s)-norcoclaurine 6位氧甲基转移酶cy6omt的步骤。

44、上文所述方法中，所述表达可为诱导表达。

45、上文所述方法中，所述原核微生物可为大肠杆菌。

46、本发明通过基因的筛选、异源表达以及酶活性的体外检测等技术对延胡索的1个omt基因进行了功能鉴定，该酶可以高效催化(s)-norcoclaurine的c6位羟基甲基化，同时具有催化底物骨架广的特点，命名为延胡索来源的(s)-norcoclaurine 6位氧甲基转移酶cy6omt。

47、本发明实施例中结果显示cy6omt对1-苄基异喹啉生物碱(1-bia)化合物(s)-去甲乌药碱((s)-norcoclaurine)的c6位羟基甲基化催化效率高，催化位点特异性较强；cy6omt催化原小檗碱型化合物四氢药根碱(tetrahyjatrorrhizine)的c3位(即异喹啉结构的c6位)羟基甲基化生成四氢巴马汀(tetrahydropalmatine)；同时cy6omt可催化小檗碱型化合物非洲防己碱(columbamine)的c2位(即异喹啉结构c7位)和药根碱(jatrorrhizine)的c3位(即异喹啉结构的c6位)羟基甲基化生成巴马汀(palmatine)。cy6omt具有对底物(s)-norcoclaurinec6位催化特异性强以及催化底物骨架广的特点。目前已报道的6omt一般不具备对小檗碱型化合物的催化功能或催化能力非常微弱。