马冠状病毒一步法RT-PCR检测试剂盒及其应用

马冠状病毒一步法rt-pcr检测试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明属于试剂盒领域，本发明涉及一种检测试剂盒及这种检测试剂盒在非疾病检测的使用方法，具体涉及一种马冠状病毒一步法rt-pcr检测试剂盒及其应用。


背景技术：

2.马冠状病毒是导致马属动物（马、驴、骡）幼驹腹泻的重要传染病之一，对马属动物产业造成严重危害。临床诊断很难将其与细菌性以及其他病毒性腹泻区分开，常导致误诊，因此该病的防控及其早期诊断显得尤为重要。目前国内尚没有可应用的马冠状病毒商品化检测试剂盒。


技术实现要素：

3.针对现阶段马冠状病毒检测试剂盒的商业化产品欠缺的问题，本发明通过设计引物采用rt-pcr的方法，得到了一种特异、敏感、快速、使用方便、廉价的用于检测马冠状病毒的一步法rt-pcr检测试剂盒，同时提供这一试剂盒在马属动物病毒性腹泻诊断检测中的使用方法。
4.本发明的技术方案如下：一种马冠状病毒一步法rt-pcr检测试剂盒，包括两条引物ecov-n-f、ecov-n-r；所述ecov-n-f序列如seq id no.1所示，具体为：acattgatggagtcttct；所述ecov-n-r序列如seq id no.2所示，具体为：ctttgtggcatccttac。
5.优选地，所述的试剂盒，还包括a. 一步法rt-pcr预混buffer；b. 扩增酶；c. 阳性rna对照；d. 阴性rna对照；e. rnase free ddh2o。
6.上述马冠状病毒一步法rt-pcr检测试剂盒在非疾病诊断目的马冠状病毒上检测上的应用。
7.上述应用的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：从待检马属动物肠道组织或粪便样品中提取rna为模板，用权利要求1所述的两条引物进行一步法rt-pcr扩增，根据所扩增的目的片段大小进行判定待检样品是否感染马冠状病毒。
8.用上述两条引物进行扩增时，引物的终浓度为：seq id no.1和seq id no.2各40 pmol/l，反应体系为：一步法rt-pcr预混buffer 12.5
µ
l，rna 2
µ
l，引物各1
µ
l，rnase free ddh2o补平至总体系25
µ
l；反应条件为：50℃ 30min；94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 10s，32个循环；72℃延伸7min；16℃保存；扩增的片段长度为：329bp。
9.本发明主要是根据马冠状病毒ecov464693株的序列设计的引物。
10.本发明的有益效果利用本发明检测试剂盒用于马冠状病毒检测，其优点在于：根据病原的保守基因的高度保守区设计特异性引物。根据扩增片段长度判断是否马冠状病毒感染，该方法方便快捷，不仅能为对症治疗提供依据，还可为马冠状病毒的流行病学调查提供可靠的信息，为及时治疗和防控疫情提供最直接的依据，为马属动物产业的健康发展保驾护航。
附图说明
11.图1：实施例2的扩增结果；图2：马冠状病毒一步法rt-pcr检测方法特异性检测结果；图3：马冠状病毒一步法rt-pcr检测方法敏感性检测结果。
具体实施方式
12.以下结合具体实例和附图说明对本发明做进一步说明，实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
13.实施例1. 马冠状病毒一步法rt-pcr引物的设计与合成通过对已知的马冠状病毒核蛋白基因序列比对，找出其保守区域，再利用primer premier 5.0软件设计引物，引物序列由擎科生物有限公司合成。引物序列和扩增长度为：seq id no.1（ecov-n-f）:acattgatggagtcttct，seq id no.2（ecov-n-r）:ctttgtggcatccttac，329bp。
14.实施例2. 马冠状病毒一步法rt-pcr检测方法的建立rna提取：trizol法或商品化rna提取试剂盒提取马肠道组织rna。
15.扩增体系：对该一步法rt-pcr方法的引物、模板等用量进行优化，多次重复试验后，最终确定反应体系为25μl：一步法rt-pcr预混buffer 12.5μl、上下游引物各1μl(引物浓度均为10 μmol/l，在反应体系中的终浓度均为40 pmol/l)、模板2μl，加rnase free ddh2o至25μl。
16.扩增程序：按照上述反应体系，将退火温度按50℃-60℃依次递增，多次重复试验后确定最佳退火温度。最终确定最佳的反应条件：50℃ 30min；94℃ 5min；94℃ 30s；55℃ 30s，72℃ 10s，32个循环；72℃延伸7min；16℃保存。
17.以上述最佳反应条件扩增结果如图1。
18.实施例3rna提取：trizol法或商品化rna提取试剂盒提取驴的粪便rna。
19.扩增体系：对该一步法rt-pcr方法的引物、模板等用量进行优化，多次重复试验后，最终确定反应体系为25μl：一步法rt-pcr预混buffer 12.5μl、上下游引物各1μl(引物浓度均为10 μmol/l，在反应体系中的终浓度均为40 pmol/l)、模板2μl，加rnase free ddh2o至25μl。
20.扩增程序：按照上述反应体系，将退火温度按50℃-60℃依次递增，多次重复试验后确定最佳退火温度。最终确定最佳的反应条件：50℃ 30min；94℃ 5min；94℃ 30s；55℃ 30s，72℃ 10s，32个循环；72℃延伸7min；16℃保存。
21.实施例4 特异性检测采用实施例2的方法扩增马常见病毒性病原：马轮状病毒、马疱疹病毒和马流感病毒，以马冠状病毒为对照。结果显示该检测方法只能特异性扩增出马冠状病毒的相应片段（泳道2），马疱疹病毒（泳道5）、马轮状病毒（泳道7）和马流感病毒（泳道9）样品无非特异性扩增片段，泳道4、6、8分别为马疱疹病毒、马轮状病毒和马流感病毒阳性对照，如图2所示，说明该检测方法具有很好的特异性。
22.实施例5 敏感性检测用nanodrop 2000超微量分光光度计测得实施例3的马冠状病毒的rna浓度为156 ng/μl，对其进行10倍倍比稀释作为模板，按照上述优化的一步法rt-pcr反应体系和优化的反应程序进行扩增，结果如图3所示，可见，1-5均有目的片段扩出，因此建立的一步法rt-pcr方法对马冠状病毒的rna最低检出限为15.6 pg。


技术特征：
1.一种马冠状病毒一步法rt-pcr检测试剂盒，其特征在于，包括两条引物ecov-n-f、ecov-n-r；所述ecov-n-f序列如seq id no.1所示，具体为：acattgatggagtcttct；所述ecov-n-r序列如seq id no.2所示，具体为：ctttgtggcatccttac。2. 根据权利要求1所述的马冠状病毒一步法rt-pcr检测试剂盒，其特征在于，还包括a. 一步法rt-pcr预混buffer；b. 扩增酶；c. 阳性rna对照；d. 阴性rna对照；e. rnase free ddh2o。3.权利要求1或2所述的马冠状病毒一步法rt-pcr检测试剂盒在非疾病诊断目的马冠状病毒上检测上的应用。4.权利要求3所述的应用的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：从待检马属动物肠道组织或粪便样品中提取rna为模板，用权利要求1所述的两条引物进行一步法rt-pcr扩增，根据所扩增的目的片段大小进行判定待检样品是否感染马冠状病毒。5. 根据权利要求4所述的使用方法，其特征在于，用权利要求1所述的两条引物进行扩增时，引物的终浓度为：seq id no.1和seq id no.2各40 pmol/l，反应体系为：一步法rt-pcr预混buffer 12.5
µ
l，rna 2
µ
l，引物各1
µ
l，rnase free ddh2o补平至总体系25
µ
l；反应条件为：50℃ 30min；94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 10s，32个循环；72℃延伸7min；16℃保存；扩增的片段长度为：329bp。

技术总结
本发明属于试剂盒领域，本发明涉及一种检测试剂盒及这种检测试剂盒在非疾病检测的使用方法，具体涉及一种马冠状病毒一步法RT-PCR检测试剂盒及其应用。通过设计引物采用RT-PCR的方法，得到了一种特异、敏感、快速、使用方便、廉价的用于检测马冠状病毒的一步法RT-PCR检测试剂盒，同时提供这一试剂盒在马属动物病毒性腹泻诊断检测中的使用方法。性腹泻诊断检测中的使用方法。性腹泻诊断检测中的使用方法。


技术研发人员：齐鹏飞 张伟 杨少华 杨宏军 朱曼玲 张亮 唐月新 解晓莉 高星熠 张诗悦
受保护的技术使用者：山东省农业科学院畜牧兽医研究所
技术研发日：2022.02.17
技术公布日：2022/4/22