一种生产丰原素的解淀粉芽孢杆菌工程菌及其构建方法与应用

本发明涉及一种生产丰原素的解淀粉芽孢杆菌工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程。

背景技术：

1、丰原素(fengycin)为一类具有较强抑制真菌活性、抑菌谱广的脂肽类抗生素，同时具有抗肿瘤，抗病毒，抗感染等生物功效，其理化性质稳定，耐热性能好，有望在植物保护、肿瘤防治等领域发挥重要作用。丰原素主要通过芽孢杆菌的非核糖体合成途径进行合成，但天然菌种受诸多因素影响，合成丰原素效率相对较低。通过对芽孢杆菌进行改造有望提高丰原素合成水平及实现产业化应用，但丰原素的工程菌株构建难度较高，合成基因簇序列长度较大，难以直接进行基因编辑操作；且不同菌种中丰原素的合成效率受到诸多培养条件因素限制，因此急需构建出一种高产丰原素的解淀粉芽孢杆菌工程菌，并发现与其对应的发酵方法。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中丰原素合成存在的技术问题，本发明提供了一种生产丰原素的解淀粉芽孢杆菌工程菌，所述解淀粉芽孢杆菌工程菌是在解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)tf28中过表达sigmah基因，所述sigmah基因的核苷酸序列如seq idno.1所示。

2、本发明还提供了上述解淀粉芽孢杆菌工程菌的构建方法，具体包括如下步骤：

3、(1)sigmah基因的克隆及合成：以解淀粉芽孢杆菌tf28的基因组为模板，利用引物对pcr扩增sigmah基因，并进行胶回收，连接，转化和鉴定；

4、(2)重组载体构建及转化：以芽孢杆菌表达载体pht43为骨架，构建重组表达载体pht43-sigmah，转化获得阳性克隆，经摇菌提取质粒；

5、(3)电转化细胞的制备：将tf28菌液预冷、离心，收集菌体，置于电转化细胞缓冲液中进行洗涤，离心，用电转化细胞缓冲液溶解菌体，于-80℃保存；

6、(4)重组载体的电转化：利用电转化仪对预冷后的步骤(2)获得的质粒和tf28菌株电转化细胞的混合液进行电转化，经培养及鉴定即得解淀粉芽孢杆菌工程菌。

7、进一步地限定，步骤(2)是以步骤(1)的连接产物pmd18t-sigmah为模板，利用pcr扩增添加bamhi和xbai两个酶切位点，获得目的片段，连接至pmd18-t载体，转化获得阳性克隆，经摇菌后提取质粒，与pht43骨架载体同步进行双酶切，分别回收pht43线性化载体及sigmah酶切产物，经连接，转化，摇菌，提取获得质粒。

8、进一步地限定，步骤(3)所述电转化细胞缓冲液的组成为以质量分数计，山梨醇8.5％，甘露醇8.5％，甘油10％，余量为水。

9、进一步地限定，步骤(3)是将tf28菌株接种至nyd液体培养基中，培养至od600为0.8～1.0，将菌液置于冰中放置30-60min，离心后获得菌体，经电转化细胞缓冲液洗涤后离心，用预冷的电转化细胞缓冲液溶解菌体，至菌体终浓度为109～2×1010cfu/ml，于-80℃保存。

10、进一步地限定，步骤(4)中的电转化参数为电压2000v，电容25μf，脉冲电阻100ω。

11、进一步地限定，步骤(4)是取总量为80-150ng的步骤(2)获得的质粒与tf28电转化细胞混合，将混合物转移至预冷的电转杯中，置于电转化仪的样品槽中进行转化，释放电脉冲，取出电转杯，立即加入1ml的nyd无抗培养基，经培养后，提取质粒，进行酶切鉴定，成功酶切的菌种即为解淀粉芽孢杆菌工程菌。

12、本发明还提供了上述解淀粉芽孢杆菌工程菌在生产丰原素中的应用。

13、进一步地限定，所述应用是将解淀粉芽孢杆菌工程菌接种于抗菌脂肽优化培养基中进行发酵；所述抗菌脂肽优化培养基的组成为：以质量分数计，酵母膏21‰，牛肉膏21‰，硫酸铵21‰，硫酸镁2.21‰，氯化钙0.1‰，硫酸锰0.1‰，磷酸二氢钾1.5‰，磷酸氢二钾3‰，果糖2.0％，葡萄糖4％，余量为水，调节ph至7.5。

14、进一步地限定，所述发酵为于28-30℃，140-200rpm的条件下培养36-48h。

15、本发明的有益效果：

16、利用本发明所述的解淀粉芽孢杆菌工程菌的构建方法获得表达阳性菌转化子的效率提高，其转化效率可达3.8×106cfu/μg dna；且利用所述的解淀粉芽孢杆菌工程菌进行发酵，可在发酵48h时达到高产丰原素的效果，阳性克隆子在发酵48h后的产量相对原始tf28菌株提高了8.01倍，由74.41mg/l增加到596.32mg/l。

技术特征：

1.一种生产丰原素的解淀粉芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌工程菌是在解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)tf28中过表达sigmah基因，所述sigmah基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述解淀粉芽孢杆菌tf28的保藏编号为cgmcc no.4038。

2.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)是以步骤(1)的连接产物pmd18t-sigmah为模板，利用pcr扩增添加bamhi和xbai两个酶切位点，获得目的片段，连接至pmd18-t载体，转化获得阳性克隆，经摇菌后提取质粒，与pht43骨架载体同步进行双酶切，分别回收pht43线性化载体及sigmah酶切产物，经连接，转化，摇菌，提取获得质粒。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述电转化细胞缓冲液的组成为以质量分数计，山梨醇8.5％，甘露醇8.5％，甘油10％，余量为水。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)是将tf28菌株接种至nyd液体培养基中，培养至od600为0.8～1.0，将菌液置于冰中放置30-60min，离心后获得菌体，经电转化细胞缓冲液洗涤后离心，用预冷的电转化细胞缓冲液溶解菌体，至菌体终浓度为109～2×1010cfu/ml，于-80℃保存。

6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)中的电转化参数为电压2000v，电容25μf，脉冲电阻100ω。

7.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)是取总量为80-150ng的步骤(2)获得的质粒与tf28电转化细胞混合，将混合物转移至预冷的电转杯中，置于电转化仪的样品槽中进行转化，释放电脉冲，取出电转杯，立即加入1ml的nyd无抗培养基，经培养后，提取质粒，进行酶切鉴定，成功酶切的菌种即为解淀粉芽孢杆菌工程菌。

8.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌工程菌在生产丰原素中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用是将解淀粉芽孢杆菌工程菌接种于抗菌脂肽优化培养基中进行发酵；所述抗菌脂肽优化培养基的组成为：以质量分数计，酵母膏21‰，牛肉膏21‰，硫酸铵21‰，硫酸镁2.21‰，氯化钙0.1‰，硫酸锰0.1‰，磷酸二氢钾1.5‰，磷酸氢二钾3‰，果糖2.0％，葡萄糖4％，余量为水，调节ph至7.5。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述发酵为于28℃-30℃，140-200rpm的条件下恒温振荡摇瓶培养36-48h。

技术总结
一种生产丰原素的解淀粉芽孢杆菌工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。为了解决现有技术中丰原素合成存在的技术问题，本发明在解淀粉芽孢杆菌TF28中过表达SigmaH基因，获得重组载体后利用电转化的方法获得解淀粉芽孢杆菌工程菌。利用本发明所述的解淀粉芽孢杆菌工程菌的构建方法获得表达阳性菌转化子的效率提高，其转化效率可达3.8×10<supgt;6</supgt;cfu/μg DNA；且利用所述的解淀粉芽孢杆菌工程菌进行发酵，可在发酵48h时达到高产丰原素的效果，阳性克隆子在发酵48h后的产量相对原始TF28菌株提高了8.01倍，产量由74.41mg/L增加到596.32mg/L。

技术研发人员：闫更轩,田缘,王向向,刘治廷,夏海华,张淑梅,于冲,胡基华,潘钰,姜威
受保护的技术使用者：黑龙江省科学院微生物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15