一种精确检测美白产品对细胞中黑色素含量影响的方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种精确检测美白产品对细胞中黑色素含量影响的方法。


背景技术：

2.随着经济的发展和人们生活水平的提高，美白功效的产品越来越受到人们的追捧，使得市面上美白功效的产的越来越多，然而目前市面上具有美白功效的产品的美白效果参差不齐，因此需要建立构建合适的检测方法检测美白产品的美白效果，现有的标准和检测方法主要是通过检测美白产品对细胞中黑色素生成量的影响，从而评价美白产品的功效。
3.现有的标准和检测方法在检测美白产品对细胞中黑色素生成量的影响时，主要有以下两种方法：(1)接种细胞数量相同，培养时长相同，用使细胞存活率不低于75％的浓度的样品，处理相同时间，最后收集到的所有细胞，用相同体积的裂解液裂解，以此得到的黑色素的含量；(2)由于现有技术发展限制，目前尚无法直接测量单个细胞中黑色素的含量，为了精确测量，目前常用的检测方法为：检测一定数量的细胞群体的总黑色素含量，再检测相同数量细胞群体中的总蛋白含量，由于总蛋白含量的相对稳定，用总黑色素含量比总蛋白含量，可得细胞内黑色素的相对含量。
4.细胞群体中黑色素的总含量通常是由两部分决定的，一是单个黑色素细胞中的黑色素含量，二是黑色素细胞的数量，在检测过程中需要对样品进行处理，如果样品处理对黑色素细胞的数量影响较大，即使不影响单个细胞黑色素的含量，也会造成整体黑色素含量的变化，因此上述方法(1)检测美白产品对细胞中黑色素生成量的影响的精确度较低，难以精确地评估样品的美白功效；上述方法(2)的检测方法通常需要采用bradford法检测细胞总蛋白含量，在检测过程中需要用到考马斯亮蓝等试剂，导致检测成本高，且染料易受强碱性缓冲液、 tritonx-100、sds等去污剂的影响，使得检测难度高，同时检测时需将细胞分成两份，会引入误差，导致检测结果的精确度大大降低。


技术实现要素：

5.针对背景技术提出的问题，本发明的目的在于提出一种精确检测美白产品对细胞中黑色素含量影响的方法，本发明通过细胞计数，使样品处理组、阳性对照组和空白对照组的细胞数量一致，再用裂解液处理，直接检测相同细胞数量的细胞群体内黑色素的含量，使得检测操作更简单，检测验结果的更准确，解决了现有黑色素检测方法精确度低和检测的难度高的问题。
6.为达此目的，本发明采用以下技术方案：
7.一种精确检测美白产品对细胞中黑色素含量影响的方法，包括以下步骤：
8.(1)检测样品对细胞活性的影响，得到细胞的存活率≥75％的样品浓度，为待测样品；
9.(2)将对数生长期的细胞接种于6孔板中，在37℃和5％co2饱和湿度环境下孵育18～24h；
10.(3)将6孔板中的细胞按照6孔板的孔数分为样品处理组、阳性对照组和空白对照组，在样品处理组中更换含有待测样品的培养基；在阳性对照组中更换含有标准美白成分的培养基，将上述样品处理组、阳性处理组和空白处理组置于培养箱中孵育24～72h；
11.(4)将步骤(3)处理后的样品处理组、阳性对照组和空白对照组分别弃去上清液后，用胰酶消化制成单细胞悬液，再离心，沉淀用含10％胎牛血清的 dmem培养基重悬细胞后计数，使样品处理组、阳性对照组和空白对照组的细胞数量一致；
12.(5)将步骤(4)处理后的样品处理组、阳性对照组和空白对照组分别进行离心处理，沉淀分别用裂解液处理后，于75～85℃的条件下孵育20～40min，用酶标仪分别测定波长475nm下样品处理组、阳性对照组和空白对照组的吸光度，并计算细胞中黑色素的含量。
13.进一步的，所述步骤(2)操作如下，将对数生长期的细胞接种于6孔板中，先在37℃和5％co2饱和湿度环境下孵育4～6h，更换含有茶碱的培养基继续培养14～18小时。
14.进一步的，在所述步骤(2)中，含有茶碱的培养基中茶碱的添加量为0.8～1 mm。
15.进一步的，在所述步骤(3)中，所述含有待测样品的培养基为含10％胎牛血清的基础培养基，并添加有待测样品和浓度为0.8～1mm的茶碱；
16.所述含有标准美白成分的培养基为含10％胎牛血清的基础培养基，并添加有标准美白成分和浓度为0.8～1mm的茶碱；
17.所述标准美白成分为熊果苷，所述标准美白成分的浓度和待测样品的浓度相同。
18.进一步的，所述步骤(1)中检测样品对细胞活性的影响的操作方法如下：将对数生长期的细胞接种于96孔板，每孔4
×
104个，37℃和5％co2的饱和湿度环境下孵育24h，加入梯度浓度的样品分别处理48h，利用mtt法检测细胞存活率，得到细胞的存活率≥75％的样品浓度，为待测样品。
19.进一步的，所述mtt法的操作方法如下：弃去96孔板内培养基，每孔加 0.4mg/mlmtt溶液100μl，在培养箱中孵育1-3h后，吸去上清，每孔加150μl 二甲基亚砜，振荡后用酶标仪分别测定波长为550nm和650nm下的吸光度，计算细胞存活率，得到细胞的存活率≥75％的浓度。
20.进一步的，所述细胞为小鼠皮肤黑色素瘤细胞。
21.进一步的，在所述步骤(5)中，所述裂解液为1mol/l的氢氧化钠溶液，且所述氢氧化钠溶液中含有10％二甲基亚砜。
22.进一步的，所述美白产品为具有美白效果的原料、提取物和组合物中的任意一种。
23.上述技术方案具有以下有益效果：
24.1、为了降低检测的难度和成本，本技术方案通过细胞计数，使样品处理组、阳性对照组和空白对照组的细胞数量一致，再用相同体积的裂解液处理，直接检测相同细胞数量的细胞群体内黑色素的含量，使得检测操作更简单，检测验结果更准确，可以排除因不同样品导致细胞数量不同，导致的黑色素含量不同而造成的误差，整个检测过程操作简单，不需要额外的试剂，实验结果能更准确的反应单个细胞产生黑色素的量的变化，且能避免使用考马斯亮蓝、强碱性缓冲液、tritonx-100、sds等试剂，对检测结果的影响，从而能大大提升检测结果的精确度和降低检测成本。
25.2、本技术方案在步骤(2)中，将对数生长期的细胞在37℃和5％co2饱和湿度环境下孵育4～6h后，更换含有茶碱的培养基继续培养14～18小时，在培养基中加入茶碱，用茶碱对细胞进行预处理后再加样品处理，茶碱能够调节细胞中促黑素细胞激素(melanocyte-stimulating hormone，msh)的产生，而msh 能够能促进黑色素生成，因此，通过在培养基中加入茶碱能够增加细胞中黑色素的基础生成量，使得比较样品处理组、阳性对照组和空白对照组三者之间黑色素含量的差异时更加显著，能更清楚和显著的评估样品的美白功效，同时也可以降低甚至避免由于人员、试剂、操作、培养环境等的变化对细胞生产黑色素能力的影响，保证检测结果的稳定性、可重复性和准确性。
具体实施方式
26.下面结合具体实施方式进一步说明本发明的技术方案。
27.一种精确检测美白产品对细胞中黑色素含量影响的方法，包括以下步骤：
28.(1)检测样品对细胞活性的影响，得到细胞的存活率≥75％的样品浓度，为待测样品；
29.(2)将对数生长期的细胞接种于6孔板中，在37℃和5％co2饱和湿度环境下孵育18～24h；
30.(3)将6孔板中的细胞按照6孔板的孔数分为样品处理组、阳性对照组和空白对照组，在样品处理组中更换含有待测样品的培养基；在阳性对照组中更换含有标准美白成分的培养基，将上述样品处理组、阳性处理组和空白处理组置于培养箱中孵育24～72h；
31.(4)将步骤(3)处理后的样品处理组、阳性对照组和空白对照组分别弃去上清液后，用胰酶消化制成单细胞悬液，再离心，沉淀用含10％胎牛血清的 dmem培养基重悬细胞后计数，使样品处理组、阳性对照组和空白对照组的细胞数量一致；
32.(5)将步骤(4)处理后的样品处理组、阳性对照组和空白对照组分别进行离心处理，沉淀分别用裂解液处理后，于75～85℃的条件下孵育20～40min，用酶标仪分别测定波长475nm下样品处理组、阳性对照组和空白对照组的吸光度，并计算细胞中黑色素的含量。
33.细胞群体中黑色素的总含量通常是由两部分决定的，一是单个黑色素细胞中的黑色素含量，二是黑色素细胞的数量，在检测过程中需要对样品进行处理，不同的处理过程会影响黑色素细胞的数量的变化，从而会造成整体黑色素含量的变化，现有技术常规的检测细胞中黑色素的含量的方法是接种细胞数量相同，培养时长相同，用使细胞存活率不低于75％的浓度的样品，处理相同时间，最后收集到的所有细胞，用相同体积的裂解液裂解，以此得到的黑色素的含量，该检测方法的精确度较低，难以精确地评估样品的美白功效，而通过改进的方法主要是用总黑色素含量比总蛋白含量，可得细胞内黑色素的相对含量，该方法在检测过程中需要用到考马斯亮蓝等试剂，导致检测成本高，且染料易受强碱性缓冲液、tritonx-100、sds等去污剂的影响，同时检测时需将细胞分成两份，会引入误差，也会导致检测结果的精确度大大降低。
34.值得说明的是，为了降低检测的难度和成本，本技术方案通过细胞计数，使样品处理组、阳性对照组和空白对照组的细胞数量一致，再用裂解液处理，直接检测相同细胞数量的细胞群体内黑色素的含量，使得检测操作更简单，检测验结果更准确，可以排除因不同样品导致细胞数量不同，导致的黑色素含量不同而造成的误差，整个检测过程操作简单，不需
要额外的试剂，实验结果能更准确的反应单个细胞产生黑色素的量的变化，且能避免使用考马斯亮蓝、强碱性缓冲液、tritonx-100、sds等试剂，对检测结果的影响，从而能大大提升检测结果的精确度和降低检测成本。
35.具体来说，在步骤(4)的具体操作过程如下，将步骤(3)处理后的样品处理组、阳性对照组和空白对照组分别弃去上清液后，用胰酶消化制成单细胞悬液，再在1000rpm的条件下离心5min，弃上清，沉淀用含10％胎牛血清的 dmem培养基重悬细胞制得细胞悬液后计数，分别取一定体积的细胞悬液离心，使样品处理组、阳性对照组和空白对照组的细胞数量一致。其中，制备细胞悬液的操作步骤为：将单细胞悬液离心去上清后，根据肉眼观察的细胞数量确定重悬所用的培养基体积，使重悬后细胞密度约为1
×
107个/ml，同时悬液的体积为50～500μl。保证各处理间细胞数量一致的步骤为：上述细胞悬液，通过细胞计数，确定每个处理得细胞密度，根据公式：细胞数量＝细胞密度
×
悬液体积，计算样品处理组、阳性对照组和空白对照组的细胞数量，以数量最少的为准，计算其他处理所需的悬液体积，从而保证各处理间细胞数量一致。
36.值得说明的是，在步骤(5)中，由于黑色素在波长为475nm时，能达到最高的吸收峰，因此本技术方案用酶标仪分别测定波长475nm下样品处理组、阳性对照组和空白对照组的吸光度，从而计算细胞中黑色素的含量，能使检测结果的准确度更高。
37.优选的，在步骤(5)中样品处理组、阳性对照组和空白对照组分别进行离心处理，沉淀分别用相同体积的裂解液处理，直接检测相同细胞数量的细胞群体内黑色素的含量，使得检测操作更简单，检测验结果更准确。
38.具体来说，在步骤(6)中，计算细胞中黑色素的含量，从而体现样品的美白效果，样品的黑色素含量(％对照)＝a457(样品处理组)/a457(空白对照组)
×
100％。
39.进一步的说明，步骤(2)操作如下，将对数生长期的细胞接种于6孔板中，先在37℃和5％co2饱和湿度环境下孵育4～6h，更换含有茶碱的培养基继续培养14～18小时。
40.细胞生成黑色素的含量受细胞状态影响，同时培养基和血清的质量、实验人员的操作、培养环境等都会影响黑色素的生成量，在实验过程中容易导致细胞产生的黑色素量波动较大，黑色素生成量不稳定，黑色素如果产量过低，会导致样品处理后，细胞黑色素含量变化较小，影响试验结果的显著性，从而难以评估样品的美白功效，而黑色素的生成量只能通过细胞聚集成一团或裂解后才能观察或检测到，若黑色素量波动较大会影响试验结果的稳定性和可重复性。
41.本技术方案，在步骤(2)中，将对数生长期的细胞先在37℃和5％co2饱和湿度环境下孵育4～6h后，更换含有茶碱的培养基继续培养14～18小时，在培养基中加入茶碱，用茶碱对细胞进行预处理后再加样品处理，茶碱能够调节细胞中促黑素细胞激素(melanocyte-stimulating hormone，msh)的产生，而 msh能够能促进黑色素生成，因此，通过在培养基中加入茶碱能够增加细胞中黑色素的基础生成量，使得比较样品处理组、阳性对照组和空白对照组三者之间黑色素含量的差异时更加显著，能更清楚和显著的评估样品的美白功效，同时也可以降低甚至避免由于人员、试剂、操作、培养环境等的变化对细胞生产黑色素能力的影响，保证检测结果的稳定性、可重复性和准确性。
42.进一步的说明，在步骤(2)中，含有茶碱的培养基中茶碱的添加量为0.8～1 mm。
43.值得说明的是，当茶碱的添加量为0.8～1mm时，细胞中黑色素的生成量较稳定，且
生成量较多，能够保证检测结果的显著性和稳定性，若茶碱的添加量小于0.8mm，则细胞中黑色素的生成量不足，难以保证检测结果的显著性，不利于评估样品的美白功效；若茶碱的添加量大于1mm，会增加检测成本。
44.优选的，本技术方案中含有茶碱的培养基中茶碱的添加量为1mm，此时细胞中黑色素的生成量稳定，且生成量较多，能够保证检测结果的显著性和稳定性。
45.值得指出的是，在生物领域，mm是指mmol/l的缩写。
46.进一步的说明，在步骤(3)中，含有待测样品的培养基为含10％胎牛血清的基础培养基，并添加有待测样品和浓度为0.8～1mm的茶碱；
47.含有标准美白成分的培养基为含10％胎牛血清的基础培养基，并添加有标准美白成分和浓度为0.8～1mm的茶碱；
48.标准美白成分为熊果苷，标准美白成分的浓度和待测样品的浓度相同。
49.值得说明的，熊果苷或曲酸为目前公知的具有美白效果的美白成品，通过更换含有熊果苷或曲酸的培养基，作为阳性对照组，分别检测样品处理组、阳性对照组和空白对照组中细胞的黑色素含量，通过对比，可评估待测样品的美白功效，同时在处理过程中标准美白成分的浓度和样品的浓度相同，更能体现待测样品的美白效果。
50.具体来说，本技术方案中的基础培养基可以是dmem培养基、rpmi1640 培养基等等。
51.进一步的说明，步骤(1)中检测样品对细胞活性的影响的操作方法如下：将对数生长期的细胞接种于96孔板，每孔4
×
104个，37℃和5％co2的饱和湿度环境下孵育24h，加入梯度浓度的样品分别处理48h，利用mtt法检测细胞存活率，得到细胞的存活率≥75％的样品浓度，为待测样品。
52.具体来说，在步骤(1)中，梯度浓度的样品是指浓度分别为50、100、200、 250、300μg/ml的样品，通过加入梯度浓度的样品，从而得到使细胞细胞的存活率≥75％的样品浓度，从而保证检测的进行。
53.进一步的说明，mtt法的操作方法如下：弃去96孔板内培养基，每孔加 0.4mg/mlmtt溶液100μl，在培养箱中孵育1-3h后，吸去上清，每孔加150μl 二甲基亚砜，振荡后用酶标仪分别测定波长为550nm和650nm下的吸光度，计算细胞存活率，得到细胞的存活率≥75％的浓度。
54.具体来说，mtt法是一种检测细胞存活和生长的方法。mtt溶液为黄色的溶液，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，其检测原理如下：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(dmso)能溶解细胞中的甲臜，用酶标仪在550nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量，在一定细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比，通过该方法能够计算得到细胞存活率，从而获得细胞的存活率≥75％的浓度。
55.本技术方案通过用酶标仪分别测定波长为550nm和650nm下的吸光度，其中，波长为550nm下的吸光度是检测物质常规的吸收峰，而波长为650nm 下的吸光度为背景吸收，背景吸收和液体的颜色没有影响，通过将波长为550nm 下的吸光值减去650nm下的吸光值，能够排除背景的影响，从而使检测结果跟准确。
56.进一步的说明，细胞为小鼠皮肤黑色素瘤细胞。
57.由于人黑色素瘤细胞生长缓慢，较难培养，因此本方案选用小鼠皮肤黑色素瘤细胞(b16-f10)进行试验，小鼠皮肤黑色素瘤细胞(b16-f10)生长速度快且容易培养，能够保证实验的有效进行，且能快速地获得实验结果。
58.进一步的说明，在步骤(5)中，裂解液为1mol/l的氢氧化钠溶液，且氢氧化钠溶液中含有10％二甲基亚砜。
59.进一步的说明，美白产品为具有美白效果的原料、提取物和组合物中的任意一种。
60.实施例1
61.一种精确检测美白产品对细胞中黑色素含量影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：
62.(1)检测样品对细胞(b16-f10)活性的影响，得到细胞的存活率≥75％的样品浓度，为待测样品；具体操作如下：将对数生长期的细胞接种于96孔板，每孔4
×
104个，37℃和5％co2的饱和湿度环境下孵育24h，加入0、100、200、300、400、500、600、700、800梯度浓度的样品分别处理48h，每个浓度设置 3个平行，利用mtt法检测细胞存活率，试验重复3次；其中，本实施例中的样品为曲酸；
63.mtt法检测细胞存活率的操作如下：弃去96孔板内培养基，每孔加0.4 mg/mlmtt溶液100μl，在培养箱中孵育2h后，吸去上清，每孔加150μl二甲基亚砜，振荡后用酶标仪分别测定波长为550nm和650nm下的吸光度，计算细胞存活率，计算结果如下表1所示，从表1可知，当曲酸的浓度为 100～800μg/ml时，细胞的存活率均大于75％，随着曲酸浓度的增加，细胞存活率逐渐的降低，当曲酸的浓度为100μg/ml时，细胞的存活率最高，为90.14％，因此，本实施例将待测样品的工作浓度设为100μg/ml；
64.(2)将对数生长期的细胞接种于6孔板中，在37℃和5％co2饱和湿度环境下孵育6h，更换含有1mm茶碱的培养基继续培养18小时；
65.(3)将6孔板中的细胞按照6孔板的孔数分为样品处理组、阳性对照组和空白对照组，在样品处理组中更换含有待测样品的培养基(含10％胎牛血清的 dmem培养基，并添加有待测样品和浓度为1mm的茶碱)，待测样品的浓度为100μg/ml；在阳性对照组中更换含有标准美白成分的培养基(含10％胎牛血清的dmem培养基，并添加有100μg/ml的熊果苷和浓度为1mm的茶碱)，每个处理设立3个平行，将上述样品处理组、阳性处理组和空白处理组置于培养箱中孵育48h；
66.(4)将步骤(3)处理后的样品处理组、阳性对照组和空白对照组分别弃去上清液后，用胰酶消化制成单细胞悬液，再在1000rpm的条件下离心5min，弃上清，沉淀用含10％胎牛血清的dmem培养基重悬细胞后计数，分别取一定体积的细胞悬液离心，使样品处理组、阳性对照组和空白对照组的细胞数量一致；其中，制备细胞悬液的操作步骤为：将单细胞悬液离心去上清后，根据肉眼观察的细胞数量确定重悬所用的培养基体积，使重悬后细胞密度为1
×
107个 /ml，同时悬液的体积为100μl；保证各处理间细胞数量一致的步骤为：上述细胞悬液，通过细胞计数，确定每个处理得细胞密度，根据公式：细胞数量＝细胞密度
×
悬液体积，计算样品处理组、阳性对照组和空白对照组的细胞数量，以数量最少的为准，计算其他处理所需的悬液体积，从而保证各处理间细胞数量一致；
67.(5)将步骤(4)处理后的样品处理组、阳性对照组和空白对照组分别进行离心处
理，沉淀分别用相同体积的裂解液(含10％dmso的1mol/l的naoh) 处理后，于80℃的条件下孵育30min，使细胞团块完全溶解，用酶标仪分别测定波长475nm下样品处理组、阳性对照组和空白对照组的吸光度，并计算细胞中黑色素的含量，检测结果如下表2所示。
68.表1实施例1中样品对细胞活性的影响检测结果
[0069][0070]
表2实施例1黑色素含量检测结果
[0071]
组别样品处理组阳性对照组空白对照组相对黑色素含量71％91％100％
[0072]
具体的，步骤(5)中通过计算处理后的细胞中黑色素的含量，来体现样品的美白效果，待测样品的黑色素含量(％对照)＝a457(样品处理组)/a457(空白对照组)
×
100％，阳性对照组的黑色素含量(％对照)＝a457(阳性对照组) /a457(空白对照组)
×
100％，从表2的检测结果可知，通过将待测样品(曲酸)、空白对照组和阳性对照组(熊果苷)的检测数据相对比，能够清晰和准确的看出待测样品对黑色素的影响，从而可以评估待测样品的的美白功效。
[0073]
实施例2
[0074]
一种精确检测美白产品对细胞中黑色素含量影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0075]
(1)检测样品对细胞(b16-f10)活性的影响，得到细胞的存活率≥75％的样品浓度，为待测样品；具体操作如下：将对数生长期的细胞接种于96孔板，每孔4
×
104个，37℃和5％co2的饱和湿度环境下孵育24h，加入50、100、200、 250、300μg/ml梯度浓度的样品分别处理48h，每个浓度设置3个平行，利用 mtt法检测细胞存活率，试验重复3次；其中，本实施例中的样品为黄山贡菊提取物，黄山贡菊提取物的提取方法如下：称取5g干燥的黄山贡菊花瓣，加入 150ml，95％的乙醇溶剂提取2h，提取液经过过滤、减压浓缩后得到粗提取物，再将粗提物溶解、经过ab-8大孔树脂纯化、用90％的乙醇洗脱，收集洗脱液再浓缩、冷冻干燥得最终产物。(王琦,郭艳明,韩建群,等.响应面法优化黄山贡菊浸提工艺[j].食品与发酵工业,2016,42(6):203-208.)；
[0076]
mtt法检测细胞存活率的操作如下：弃去96孔板内培养基，每孔加0.4 mg/mlmtt溶液100μl，在培养箱中孵育2h后，吸去上清，每孔加150μl二甲基亚砜，振荡后用酶标仪分别测定波长为550nm和650nm下的吸光度，计算细胞存活率，计算结果如下表3所示，从表3可知，当样品的浓度为50～100 μg/ml时，细胞的存活率较高，细胞的存活率均大于75％，本实施例将浓度为 100μg/ml的样品作为待测样品；
[0077]
(2)将对数生长期的细胞接种于6孔板中，在37℃和5％co2饱和湿度环境下孵育5h，更换含有1mm茶碱的培养基继续培养18小时；
[0078]
(3)将6孔板中的细胞按照6孔板的孔数分为样品处理组、阳性对照组和空白对照组，在样品处理组中更换含有待测样品的培养基(含10％胎牛血清的 dmem培养基，并添加有待测样品和浓度为1mm的茶碱)，待测样品的浓度为100μg/ml；在阳性对照组中更换含有标准美白成分的培养基(含10％胎牛血清的dmem培养基，并添加有100μg/ml的熊果苷和浓度为1mm的茶碱)，每个处理设立3个平行，将上述样品处理组、阳性处理组和空白处理组置于培养箱中孵育48h；
[0079]
(4)将步骤(3)处理后的样品处理组、阳性对照组和空白对照组分别弃去上清液后，用胰酶消化制成单细胞悬液，再在1000rpm的条件下离心5min，弃上清，沉淀用含10％胎牛血清的dmem培养基重悬细胞后计数，分别取一定体积的细胞悬液离心，使样品处理组、阳性对照组和空白对照组的细胞数量一致；其中，制备细胞悬液的操作步骤为：将单细胞悬液离心去上清后，根据肉眼观察的细胞数量确定重悬所用的培养基体积，使重悬后细胞密度为1
×
107个 /ml，同时悬液的体积为100μl；保证各处理间细胞数量一致的步骤为：上述细胞悬液，通过细胞计数，确定每个处理得细胞密度，根据公式：细胞数量＝细胞密度
×
悬液体积，计算样品处理组、阳性对照组和空白对照组的细胞数量，以数量最少的为准，计算其他处理所需的悬液体积，从而保证各处理间细胞数量一致；
[0080]
(5)将步骤(4)处理后的样品处理组、阳性对照组和空白对照组分别进行离心处理，沉淀分别用相同体积的裂解液(含10％dmso的1mol/l的naoh) 处理后，于80℃的条件下孵育30min，使细胞团块完全溶解，用酶标仪分别测定波长475nm下样品处理组、阳性对照组和空白对照组的吸光度，并计算细胞中黑色素的含量，检测结果如下表4所示。
[0081]
表3实施例2中样品对细胞活性的影响检测结果
[0082][0083]
表4实施例2黑色素含量检测结果
[0084]
组别样品处理组阳性对照组空白对照组相对黑色素含量83.48％91％100％
[0085]
具体的，步骤(5)中通过计算处理后的细胞中黑色素的含量，来体现样品的美白效果，待测样品的黑色素含量(％对照)＝a457(样品处理组)/a457(空白对照组)
×
100％，阳性对照组的黑色素含量(％对照)＝a457(阳性对照组) /a457(空白对照组)
×
100％，从表4的检测结果可知，通过将样品、空白对照组和阳性对照组的检测数据相对比，能够清晰和准确的看出待测样品对黑色素的影响，从而可以评估待测样品的的美白功效。
[0086]
以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理。这些描述只是为了解释本发明的原理，而不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处的解释，本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。