胎盘外泌体的提取方法及应用与流程

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种胎盘外泌体的提取方法及应用。


背景技术：

2.外泌体是细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程形成的膜性脂质小囊泡，作为天然的细胞间通讯递质，在机体的多种生理病理进程中都起到了关键作用，包括细胞间信号传导、免疫调控、干细胞生长与分化等。外泌体在各细胞间充当通讯介质的方式主要有3种：一是直接识别靶细胞表面的信号分子并与受体结合，向细胞传递信息；二是与靶细胞质膜融合后，释放所携带的内容物，实现信息传递；三是通过释放胞内的信号分子作用于靶细胞表面受体，完成信息转运。不同来源的外泌体通常具有与其来源细胞相一致的生物学功能，例如间充质干细胞来源的外泌体具有促进干细胞分化的作用，因此被用来促进组织损伤的修复。此外，间充质来源的外泌体还可以抑制前期炎症因子的表达，通过加强细胞外基质的重塑达到抗炎、抗纤维化和促进组织再生的作用。
3.胎盘作为生命体的起源，内含丰富的干细胞成分，其释放的外泌体除具有间充质干细胞外泌体的生物成分及作用之外，还具有更为丰富的有效成分及生物学活性。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种胎盘外泌体的提取方法及应用，本发明的外泌体提取方法，可以获得产量高、浓缩程度高、纯度高的胎盘来源外泌体。
5.本发明的目的通过以下技术方案实现：
6.一种胎盘外泌体的提取方法，包括以下步骤：
7.(1)获取目标胎盘，清洗后加入30mm的nahco3缓冲液，将胎盘剪碎成组织块；
8.(2)将剪碎后的组织块转入匀浆器中，在4℃条件下，点振式开启10秒，停10秒，循环3次，制得匀浆液；
9.(3)将匀浆液采用离心机，在4℃条件下，7000rpm离心1h，取上层清液，再于7000rpm离心0.5h，收集上清液；
10.(4)在4℃条件下，将上清液先用滤纸进行减压抽滤，再用0.45μm滤膜进行减压抽滤，最后使用0.22μm滤膜抽滤进行减压抽滤，收集抽滤物；
11.(5)在4℃条件下，将步骤(4)得到的抽滤物使用100-kda膜包进行超滤浓缩，pbs缓冲液换液，得到浓缩液；
12.(6)将浓缩液进行色谱尺寸排阻，然后采用离心超滤管进行浓缩，并使用生理盐水进行换液，得到胎盘外泌体。
13.优选地，所述步骤(1)中胎盘与加入nahco3缓冲液的质量比为1：4-8。
14.优选地，所述步骤(6)中色谱尺寸排阻具体过程为：在4℃条件下，使用pbs缓冲液平衡3个柱体积，最大流速1ml/min，使用5ml上样环进行上样，然后采用0.5ml/min流速的pbs进行洗脱，根据出峰体积进行收样，洗脱完一个柱体积之后，将峰冲平便可继续上样、洗
脱。
15.优选地，所述pbs缓冲液的制备方法如下：称取8g的nacl、0.2g的kcl、0.24g的kh2po4、3.628g的na2hpo4·
12h2o，溶于900ml纯净水中，用盐酸调ph值至7.4，加纯净水定容至1l，0.22μm滤膜过滤，高压灭菌，常温保存备用。
16.上述提取方法制得的胎盘外泌体，应用于抗衰老和组织修复方面。
17.本发明的有益效果是：
18.1、本发明提取的外泌体相比培养上清而言不仅量大，可以极大节省成本，而且外泌体所包含的抗衰老蛋白更加丰富。
19.2、经典的外泌体提取方法是采用超高速离心的方法，在放大生产中很难实现，而且所提取的外泌体杂质成分较少，损耗也极大。本发明采用超滤结合分子筛的方法，可以极大的减少外泌体的损耗，且经过分子筛的选择作用，杂质蛋白可以被更好地去除，从而得到纯度更高的外泌体。
附图说明
20.图1胎盘外泌体与间充质干细胞外泌体蛋白成分对比(western blot法)；
21.图2胎盘外泌体与间充质干细胞外泌体蛋白浓度对比(bca法)；
22.图3胎盘外泌体与间充质干细胞外泌体tem图；
23.图4胎盘外泌体与间充质干细胞外泌体颗粒数目和纯度对比(nta鉴定)；
24.图5胎盘外泌体与间充质干细胞外泌体中鉴定的共有和独特的蛋白质；
25.图6胎盘外泌体外泌体分离纯化(hiprep 16/60sephacryl s-400hr分子筛)；
26.图7胎盘外泌体sds-page检测结果；
27.图8胎盘外泌体western blot检测结果；
28.图9胎盘外泌体与间充质干细胞外泌体cck-8检测细胞增殖；
29.图10胎盘外泌体与间充质干细胞外泌体抗氧化指标sod活性检测。
具体实施方式
30.为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
31.本发明所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
32.1、pbs缓冲液配制
33.称取8g的nacl、0.2g的kcl、0.24g的kh2po4、3.628g的na2hpo4·
12h2o，溶于900ml纯净水中，用盐酸调ph值至7.4，加纯净水定容至1l，0.22μm滤膜过滤，高压灭菌，常温保存备用。
34.2、外泌体的提取
35.本发明实施例胎盘外泌体的提取：
36.(1)获取目标胎盘，清洗后加入30mm的nahco3缓冲液，将胎盘剪碎成组织块，胎盘与加入nahco3缓冲液的质量比为1：4-8，将胎盘剪碎成组织块；
37.(2)将剪碎后的组织块及nahco3缓冲液放入匀浆器中，在4℃条件下，点振式开启10秒，停10秒，循环3次，制得匀浆液；
38.(3)将匀浆液采用离心机，在4℃条件下，7000rpm离心1h，取上层清液，再于7000rpm离心0.5h，收集上清液；
39.(4)在4℃条件下，将上清液先用滤纸进行减压抽滤，再用0.45μm滤膜进行减压抽滤，最后使用0.22μm滤膜抽滤进行减压抽滤，收集抽滤物；
40.(5)在4℃条件下，将步骤(4)得到的抽滤物使用100-kda膜包进行超滤浓缩，pbs缓冲液换液，得到浓缩液；
41.(6)将浓缩液进行色谱尺寸排阻，在4℃条件下，使用pbs缓冲液平衡3个柱体积，最大流速1ml/min，使用5ml上样环进行上样，然后采用0.5ml/min流速的pbs进行洗脱，根据出峰体积进行收样，并收集杂蛋白用于鉴定对照，洗脱完一个柱体积之后，将峰冲平便可继续上样、洗脱。然后采用ultra10-kda离心超滤管进行浓缩，并使用生理盐水进行换液3次，得到胎盘外泌体。
42.对比例间充质干细胞外泌体的提取：
43.取新鲜脐带10cm，pbs洗去残留血液，剪成2～3cm的小段，再次漂洗，用眼科剪纵向将脐带的一条静脉和两条动脉剔除，并剥离胎膜，最后将脐带剪成0.5～1cm3，置于培养皿中培养；5天后弃去非贴壁细胞，继续用α-mem基本培养基(10％胎牛血清、100u/ml青霉素和链霉素)培养贴壁细胞，37℃、5％co2培养箱平面单层培养，2～3天换一次新鲜培养液；待细胞达80％～90％时，换含2％胎牛血清的培养液培养，24h后收集培养液上清液，800
×
g离心10min，收集上清液；再将上清液通过2000
×
g离心30min，收集上清液；最后将上清液通过16000
×
g离心60min，弃上清液，所得沉淀即为脐带间充质干细胞外泌体。
44.3、外泌体的鉴定方法
45.(1)sds-page和western blot法鉴定
46.sds-page和western blot采用常规10％浓度的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶；western blot一抗采用外泌体特征蛋白cd63、cd81、tsg101单克隆抗体，以及外泌体常见杂质蛋白calregulin单克隆抗体，二抗采用hrp标记的igg抗体。
47.(2)bca法蛋白浓度测定
48.bca试剂盒采用biosharp bca蛋白浓度测定试剂盒。bca测定浓度c，最终外泌体浓度c(exosomes)＝1.4*c。
49.(3)tem(transmission electron microscope，透射电镜)鉴定
50.采用的外泌体透射电镜分辨率为0.1～0.2nm，可观察到外泌体双层囊膜超微结构，通常为一侧凹陷的半球形，并可同时测量外泌体大小，通常为30～150nm。
51.检测平台tecnaitm g2 spirit biotwin。
52.(4)nta(nanoparticle tracking analysis，纳米颗粒跟踪分析)鉴定
53.采用英国malvern公司nanosight纳米颗粒跟踪分析仪对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析，结合stockes-einstein方程式计算出外泌体颗粒的流体力学直径和浓度。
54.4、胎盘外泌体与间充质干细胞外泌体成分鉴定与分析
55.分别采用western blot法、bca法、tem鉴定、nta鉴定及质谱分析法对胎盘外泌体和间充质干细胞外泌体的蛋白含量、蛋白浓度、颗粒浓度、颗粒纯度以及蛋白种类进行对
比，结果如图1-5的所示：
56.western blot法：
57.mscs泳道代表间充质干细胞培养基上清液提取的外泌体，p-f1泳道代表胎盘提取的外泌体成分，p-f2泳道代表胎盘提取外泌体时产生的杂质蛋白成分。每个泳道采取10ug蛋白上样，从图1可以看出，胎盘提取的外泌体和经典的间充质干细胞培养上清提取的外泌体相比，都具有外泌体的典型蛋白标志cd81和cd63，且该提取方法得到的胎盘外泌体中的杂质蛋白钙网蛋白(calregulin)相比间充质干细胞少很多(泳道p-f1相较于mscs泳道)。
58.bca标准曲线：
59.bca法检测蛋白浓度：取50μl外泌体，先稀释10倍，加入20μl ripa裂解液，冰上裂解30min，采用bca检测试剂盒检测蛋白浓度，配制标准曲线，最终蛋白总浓度c总＝c检测
×
14。检测结果可以看出一个胎盘提取的外泌体总蛋白约等于10000ml间充质干细胞上清液提取的外泌体总蛋白量。
60.将外泌体蛋白测出的od562分别带入到图2所示公式进行计算，提取得到的外泌体蛋白浓度及总质量见下表1和表2：
61.表1
[0062][0063][0064]
表2
[0065][0066]
图3为透射电镜分析间充质干细胞和胎盘来源的外泌体，可观察到两种来源的外泌体都具有经典结构形态，双层囊膜超微结构，通常为一侧凹陷的半球形。
[0067]
图4为nta测试结果。显示间充质干细胞和胎盘来源的外泌体粒径大小符合经典外泌体粒径30～150nm。从颗粒数目判读，一个胎盘提取的外泌体的颗粒数目约等于27000ml的间充质干细胞上清提取的外泌体数量。
[0068]
5、胎盘来源外泌体的有效成分及应用
[0069]
胎盘外泌体含有多种蛋白质、脂质体、rna和dna等有效成分，在损伤修复方面具有修复创面、抗炎、抗纤维化(瘢痕)的作用，在美容抗衰方面具有消炎、抗氧化、延缓皮肤衰老等作用。图5venn图分析结果如下：胎盘来源的外泌体相较于间充质干细胞来源的外泌体，其蛋白质种类更多。经质谱结果分析，本发明的胎盘外泌体中包含六种与衰老密切相关的蛋白，分别为fn1蛋白，apoe蛋白，nampt蛋白，apoc3蛋白，adipoq蛋白和ap2蛋白。前两种蛋白(fn1蛋白，apoe蛋白)在间充质干细胞外泌体中已有报道，而nampt蛋白，apoc3蛋白，adipoq蛋白和ap2蛋白则为本发明首次于胎盘外泌体中发现。
[0070]
如图6所示，采用分子筛s400进行外泌体纯化，根据蛋白质以及颗粒度的大小进行分离，最先洗脱下来的是较大的蛋白(或大颗粒)，最后洗脱下来的是杂质蛋白。柱体积为120ml，在35-75ml即峰f1最先洗脱下来的是最大的颗粒，即外泌体，后续75-185ml即峰f2洗脱下来的即为小分子的蛋白，也就是除去颗粒外的杂质蛋白。峰f1收集的即是外泌体。
[0071]
图7为sds-page图，采用10％分离胶进行电泳，左侧泳道显示的是纯化的外泌体的总蛋白的sds-page图。右边泳道显示对应的蛋白质maker。图8western blot检测结果正确。tsg101蛋白分子量大约44kd。cd9蛋白分子量大约24kd。采用特异性的一抗进行western blot进行检测，且显影分子量在正确范围内，所以结果正确可信。
[0072]
胎盘外泌体westernblot检测cd9、tsg101蛋白的表达情况，结果见图8。结果显示，本发明实施例制备的胎盘外泌体可检测cd9和tsg101蛋白的表达。
[0073]
6、胎盘外泌体在修复损伤方面的作用
[0074]
痘痕修复测试，以玻尿酸等相关溶媒为辅佐，微针滚入200ug外泌体，使用1次，恢复7天之后在相同光照下进行对比，相同光影下，痘痕明显弱化，且痘痕周围的皮肤褶皱大幅度减少，皮肤更加水润光泽。发现外泌体对其痘痕修复有明显的促进效果。
[0075]
7、胎盘外泌体在延缓皮肤衰老方面的作用
[0076]
(1)cck-8检测细胞增殖：评估placenta-exos对衰老人皮肤成纤维细胞(hdfs)增殖表型的改善作用，结果如图9所示。实验步骤如下，将8
×
104/ml的hdfs接种至96孔细胞培养板培养24h，各组均培养3d(期间每隔48h换液，不传代培养)，实验组外泌体浓度为50μg/ml。按照cck-8试剂说明书，每孔加入10μl cck-8试剂，置于37℃，5％co2培养箱孵育3h后，用酶标仪测量波长为450nm的光密度值d(450)。按公式计算细胞增殖率[实验组d(450)值/对照组d(450)值
×
100％]；
[0077]
图9细胞增殖实验结果显示，与pbs处理组相比，50ug/ml的间充质干细胞外泌体和胎盘外泌体处理组对hdfs增殖能力影响具有显著的差异，明显的提高。说明外泌体对于hdfs的增殖能力具有促进效果。此外，与间充质干细胞外泌体处理组相比，胎盘外泌体处理的hdfs增殖能力更强，具有显著性差异。说明与经典的间充质干细胞外泌体相比，我们制备的新型胎盘外泌体对于细胞的增殖促进效果更佳。
[0078]
(2)抗氧化指标sod活性检测：sod是重要的抗氧化酶，其活性越强，抗氧化作用越强，检测经处理的衰老hdfs细胞的sod，结果如图10所示。实验步骤如下，50μg/ml外泌体处理3d后，10000g离心10分钟取hdfs细胞上清用于后续测定。配置wst-8工作液，取1.5ml ep管分别加入151μl sod检测缓冲液，8μl wst-8和1μl酶溶液。反应启动工作液的配置如下，1μl反应启动液(40
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)与39μl sod检测缓冲液混匀。检测时，取20μl待测样品，加入160μl wst-8/酶工作液和20μl反应启动工作液，450nm波长条件下测定吸光度，计算sod活力。
[0079]
图10结果显示，使用间充质干细胞外泌体和胎盘外泌体处理组的hdfs的上清sod活性极显著高于pbs处理组，且胎盘外泌体处理组显著高于间充质干细胞外泌体处理组。说明胎盘外泌体对于sod活性的提高具有显著的作用。且比经典的间充质干细胞外泌体的提升效果更好。
[0080]
其中：柱状图中的*号代表两者具有统计学差异，一个*代表p《0.05，两个*代表p《0.01，三个*代表p《0.001，四个*代表p《0.0001，p值越小，差异越显著。
[0081]
根据上述说明书的揭示，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。