受黄龙病菌和脱落酸诱导的植物启动子及其应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种受黄龙病菌和脱落酸诱导的植物启动子及其应用。


背景技术：

2.柑橘是具有重要经济价值的一种水果。由亚洲黄龙病菌(candidatus liberibacter asiaticus，简称clas)引起的“黄龙病(huanglongbing,简称hlb)”因其症状严重、传播速度快、影响所有商业柑橘种类，成为了最具毁灭性的柑橘疾病，对柑橘业影响巨大。如何利用当今迅速发展的基因工程技术，从根本上提高柑橘的黄龙病抗性，是柑橘业领域重要的研究课题。
3.目前在柑橘属植物中还没有发现抗黄龙病的种质，也没有从感病植株中彻底根除黄龙病菌的有效方法。因而，培育抗病品种是控制黄龙病最根本的方法，对柑橘产业的可持续健康发展有至关重要的作用。诱导植物产生系统获得抗性，以及在植物中表达对病原菌有杀灭作用的外源基因是目前抗病育种的重要手段。而在外源基因表达过程中，启动子则起着关键的作用。
4.启动子是决定外源基因转录效率的关键因素。按照基因的表达方式，习惯上将植物基因的启动子分为组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。目前植物基因工程中常用的是组成型启动子，如在双子叶植物中表达效率较高的烟草花椰菜病毒(camv)35s启动子，而在单子叶植物中常用的启动子是来自于水稻的rbcs、actin1和oscc1启动子及玉米的rubq1和rubq2启动子等。然而，外源基因在受体植物内持续、高效表达不仅造成植物能量和养分的浪费，往往还会使某些性状发生改变，影响植株的正常生长发育。因此，为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时减少对植物的不利影响，特异性启动子和诱导性启动子则成为了最佳选择。但迄今为止，还尚未见有关黄龙病菌诱导型启动子的研究报道。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种受黄龙病菌和脱落酸诱导的植物启动子，具有明显的黄龙病菌和脱落酸诱导启动活性，能使细胞在受到黄龙病菌感染和脱落酸诱导时启动外源基因的表达。本发明的目的之二在于提供含有所述启动子的重组表达载体。本发明的目的之三在于提供所述启动子和含有所述启动子的重组表达载体的应用。
6.为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
7.1.受黄龙病菌和脱落酸诱导的植物启动子，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.2.含有所述受黄龙病菌和脱落酸诱导的植物启动子的重组表达载体。
9.3.所述受黄龙病菌和脱落酸诱导的植物启动子在柑橘基因工程育种中的应用。
10.4.所述含有受黄龙病菌和脱落酸诱导的植物启动子的重组表达载体在柑橘基因工程育种中的应用。
11.本发明的有益效果在于：本发明提供了一种受黄龙病菌和脱落酸诱导的植物启动子，具有明显的黄龙病菌和脱落酸诱导启动活性，能使细胞在受到黄龙病菌感染和脱落酸诱导时启动外源基因的表达。本发明所述的启动子可用于柑橘黄龙病菌的防治以及柑橘抗黄龙病菌品系的基因工程育种。
附图说明
12.图1为cscals5启动子的顺式作用元件；
13.图2为cscals5p的pcr扩增结果示意图；
14.图3为cscals5p::gus融合表达载体结构示意图；
15.图4为cscals5p::gus融合表达植株pcr鉴定结果示意图；
16.图5为cscals5p::gus融合表达植株表型结果图；
17.图6为脱落酸对启动子转基因植株gus基因的诱导表达结果示意图；
18.图7为黄龙病菌对启动子转基因植株gus基因的诱导表达结果示意图。
具体实施方式
19.下面通过具体实施例对本发明进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
20.1.受黄龙病菌和脱落酸诱导的植物启动子的选择与克隆
21.申请人研究发现，柑橘cscals5、cscals7和cscals8在黄龙病菌(candidatus liberibacter asiaticus，clas)侵染的
‘
砂糖橘’(citrus reticulata)和
‘
强德勒柚’(c.grandis)中表达量显著上升。但分析推测的氨基酸序列后发现cscals7和cscals8都缺失保守结构域，因此申请人选择cscals5进行进一步研究。克隆
‘
锦橙’cscals5的启动子序列并进行生物信息学分析，结果发现，cscals5的启动子序列上含有2个gt1 box，23个dofbox和2个w box顺式作用元件，如图1所示。基于此，申请人以cscals5的启动子为候选启动子，以锦橙dna为模板，利用引物对5p-f/5p-r(5p-f：5'aa ctgcagctcatgctttatgccttt3'(pstⅰ)；5p-r：5'cgggatcccttttgcctctataaatatgat3'(bamhⅰ))成功扩增了cscals5起始密码子atg上游1500bp的启动子序列，如图2所示。将其与pgem-t载体进行t/a连接转化感受态dh5α测序获得启动子序列信息，如seq id no.1所示。
22.2.构建cscals5p::gus融合载体
23.对测序正确的克隆提取质粒，进行pstⅰ和bamhⅰ双酶切，回收目的片段，通过酶切连接法，用cscals5p替换gngm1300载体上的35s启动子，成功获得了cscals5p::gus融合表达载体，如图3所示。
24.3.cscals5p::gus转基因植株的鉴定
25.通过gfp初筛和pcr检测，结果如图4所示，共得到5个cscals5p::gus融合表达株系，分别标记为g23、g29、g30、g57和g58(如图5所示)。对转基因植株进行观察发现，其表型与野生型植株无明显差异，如图5所示。
26.4.脱落酸诱导cscals5p驱动的gus基因上调表达
27.取cscals5p::gus转基因植株叶圆片，用无菌水和脱落酸分别处理0和48h，检测
gus基因的相对表达量。结果显示，与同期水对照相比，脱落酸处理48h后，cscals5p::gus转基因植株中的gus基因均上调表达，其中g23、g29和g57经脱落酸诱导48h后，gus基因的表达量显著上调，分别为同期对照的2.09、2.30和1.93倍，结果如图6所示。
28.5.cscals5p启动子在clas的诱导下，表达活性增强
29.与健康转基因对照相比，接种黄龙病菌6个月后转基因植株中cscals5p驱动gus基因表达量上调2倍左右，结果如图7所示。
30.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所有的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。


技术特征：
1.受黄龙病菌和脱落酸诱导的植物启动子，其核苷酸序列如seq id no.1所示。2.含有权利要求1所述的受黄龙病菌和脱落酸诱导的植物启动子的重组表达载体。3.权利要求1所述的受黄龙病菌和脱落酸诱导的植物启动子在柑橘基因工程育种中的应用。4.权利要求2所述的重组表达载体在柑橘基因工程育种中的应用。

技术总结
本发明公开了一种受黄龙病菌和脱落酸诱导的植物启动子及其应用，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其具有明显的黄龙病菌和脱落酸诱导启动活性，能使细胞在受到黄龙病菌感染和脱落酸诱导时启动外源基因的表达，可用于柑橘黄龙病菌的防治以及柑橘抗黄龙病菌品系的基因工程育种。品系的基因工程育种。品系的基因工程育种。


技术研发人员：姚利晓 陈善春 何永睿 张庆雯 王兆昊 邹修平 雷天刚 彭爱红 许兰珍 李强 龙琴
受保护的技术使用者：西南大学
技术研发日：2022.04.06
技术公布日：2022/7/21