鉴别‘牡丹茶’滇山茶品种的分子特异性标记引物及鉴定方法

本发明涉及鉴别‘牡丹茶’滇山茶品种的分子特异性标记引物，以及该特异性标记引物对‘牡丹茶’滇山茶品种进行快速鉴定的方法。

背景技术：

1、滇山茶(camelliareticulata)，属于山茶科(theaceae)山茶属(camellia)红山茶组(sectcamellia)，常绿阔叶乔木。滇山茶原产中国云南，适应我国西南山地及其独特的高原季风气候，是中国的特有种、国家重点二级保护植物，且被iucn(internationalunionforconservationofnature)列为“vulnerable”(易危种)。它不仅是世界珍稀花卉之一、最受云南人民喜爱的八大名花之首，同时也是云南省花、昆明市花，更是被广泛认可的古老而名贵的观赏树木，已被作为观赏植物栽培了1500多年，具有极高的经济价值。加之我国民众自古即高度重视观赏树木的文化韵味，千姿百态、变化多端的滇山茶之娇艳，被广泛地应用到了园林绿化及盆栽观赏中。此外，又由于其树体高大(最高25m)而名扬海外，受到世界园艺界的珍视，先后被引种到全球多地进行栽培。

2、滇山茶栽培种质的变异丰富，园艺品种有100多个，其中不乏价格昂贵的名贵品种，如‘恨天高’、‘紫袍’、‘牡丹茶’等。实践中，一些品种的形态特征相似度高，很难从形态特征上进行鉴别，能准确掌握滇山茶的形态分类技术的仅有少数专业人士，给滇山茶的应用、推广以及新品种选育带来很多困难。尤其是以下两个问题一直较难解决：一是未到花期植株的品种早期鉴定，二是形态特征相似的品种鉴别。

3、鉴于上述情况，有必要研究鉴别‘牡丹茶’滇山茶品种的分子特异性标记引物及鉴定方法以解决上述技术问题。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的在于提供‘牡丹茶’滇山茶品种的分子特异性标记引物，本发明的第二个目的在于提供利用的分子特异性标记引物对‘牡丹茶’滇山茶品种进行鉴定的方法。本发明旨在解决无法对未到花期且形态特征相似的滇山茶品种进行早期鉴定的技术问题。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的第一个目的是这样实现的，‘牡丹茶’滇山茶品种的分子特异性标记引物，该特异性标记引物序列如下：

4、上游引物：5'-atcgccaacagaaacaacacgc-3'；

5、下游引物：5'-attcacatctaatgagcgaaggttg-3'。

6、本发明的第二个目的是这样实现的，利用所述分子特异性标记引物对‘牡丹茶’滇山茶品种进行鉴定的方法，所述方法为：

7、(1)提取待测滇山茶品种叶片的基因组dna；

8、(2)以步骤(1)提取的滇山茶品种叶片的基因组dna作为扩增模板，利用权利要求1所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；

9、(3)对步骤(2)中的扩增产物进行电泳检测，电泳结束后用eb染色，于tanon凝胶成像仪拍照记录结果，将电泳结果与dl2000marker进行对比，若条带大小为700bp，则对扩增产物进行dna双向测序，获得扩增产物dna序列；

10、(4)如步骤(3)中所述扩增产物的dna序列能与ncbi(nationalcenterforbiotechnologyinformation)线上数据库的单拷贝核基因(mh257926)序列成功比对，且所述扩增产物在58bp、165bp中的至少一个bp上出现特异性位点，则待测滇山茶品种为‘牡丹茶’，反之则否；所述58bp的核苷酸碱基为t，所述165bp的核苷酸碱基为a。

11、优选地，步骤(1)中所述提取待测滇山茶品种叶片的基因组dna的方法为：取待测滇山茶叶片，加液氮磨碎后，以改良ctab法进行基因组dna提取。

12、优选地，步骤(2)中所述cr扩增体系，每50μl组成为：25μltaq混合物；1μldna模板；22μlddh2o；1μl浓度为10p的上游引物；1μl浓度为10p的下游引物。

13、优选地，步骤(2)中所述pcr扩增条件为：在98℃下初始变性2min，再在98℃下变性10s，60℃退火10s，72℃下延伸20s，进行35个循环；最后在72℃下延伸5分钟。

14、本发明方法关键在于扩增引物的选择、dna提取、pcr反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。

15、优选地，所述步骤(3)中的电泳检测方法为：取步骤(2)中的扩增产物2μl，与6μl1×溴酚蓝缓冲液混匀，点样于1.0％的琼脂糖凝胶上，于0.5×tbe缓冲液中，恒压300v电压下电泳12分钟。

16、优选地，步骤(3)中所述扩增产物进行dna双向测序时采用一代3730测序仪。

17、优选地，步骤(4)中所述单拷贝核基因长度为700bp，在ncbi线上数据库的genbank登录号为mh257926。

18、该引物经过大量筛选试验获得滇山茶品种能够在滇山茶及近缘物种中扩增出直系同源的单拷贝核基因。所述引物扩增的单拷贝核基因在ncbi线上数据库genbank登录号为mh257926，长度700bp，在58bp位点的核苷酸碱基为t，具有特异性，能与其它滇山茶品种在该位点的核苷酸碱基a进行区别，以及在165bp位点的核苷酸碱基为a，具有特异性，能与其它滇山茶品种在该位点的核苷酸碱基c进行区别，可实现滇山茶品种‘牡丹茶’的分子鉴别。需要说明的是，本发明分子特异性标记引物仅限于滇山茶品种的鉴定(鉴定其是否为‘牡丹茶’)，即待测样品仅限于滇山茶。

19、本发明方法关键在于扩增引物的选择、dna提取、pcr反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行，通过测序位点验证，能简单、准确、可靠的实现滇山茶品种‘牡丹茶’的分子鉴别。

20、综上所述，相比于现有技术，本发明的有益效果在于：

21、1、本发明在前期的滇山茶转录组测序、单拷贝核基因筛选的基础上，以滇山茶的主要栽培品种为实验对象，针对形态上难以鉴别的品种，筛选出了部分品种的分子特异性标记引物，pcr扩增测序后，可从单拷贝核基因序列上的特异性位点进行部分滇山茶品种的分子鉴定。

22、2、本发明的分子特异性标记引物可对滇山茶品种‘牡丹茶’与其它滇山茶主要栽培品种进行分子鉴别，尤其适合对未到花期植株的滇山茶品种的早期鉴定，以及形态特征相似的品种进行鉴别。

23、3、本发明鉴定方法简单、快捷准确。

技术特征：

1.‘牡丹茶’滇山茶品种的分子特异性标记引物，其特征在于，该特异性标记引物序列如下：

2.一种利用权利要求1所述的分子特异性标记引物对‘牡丹茶’滇山茶品种进行鉴定的方法，其特征在于所述方法为：

3.如权利要求2所述的对‘牡丹茶’滇山茶品种进行鉴定的方法，其特征在于，步骤(1)中所述提取待测滇山茶品种叶片的基因组dna的方法为：取待测滇山茶叶片，加液氮磨碎后，以改良ctab法进行基因组dna提取。

4.如权利要求2所述的对‘牡丹茶’滇山茶品种进行鉴定的方法，其特征在于，步骤(2)中所述cr扩增体系，每50μl组成为：25μl taq混合物；1μl dna模板；22μlddh2o；1μl浓度为10p的上游引物；1μl浓度为10p的下游引物。

5.如权利要求2所述的对‘牡丹茶’滇山茶品种进行鉴定的方法，其特征在于，步骤(2)中所述pcr扩增条件为：在98℃下初始变性2min，再在98℃下变性10s，60℃退火10s，72℃下延伸20s，进行35个循环；最后在72℃下延伸5分钟。

6.如权利要求2所述的对‘牡丹茶’滇山茶品种进行鉴定的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的电泳检测方法为：取步骤(2)中的扩增产物2μl，与6μl1×溴酚蓝缓冲液混匀，点样于1.0％的琼脂糖凝胶上，于0.5×tbe缓冲液中，恒压300v电压下电泳12分钟。

7.如权利要求2所述的对‘牡丹茶’滇山茶品种进行鉴定的方法，其特征在于，步骤(3)中所述扩增产物进行dna双向测序时采用一代3730测序仪。

8.如权利要求2所述的对‘牡丹茶’滇山茶品种进行鉴定的方法，其特征在于，步骤(4)中所述单拷贝核基因长度为700bp，在ncbi线上数据库的genbank登录号为mh257926。

技术总结
本发明公开了鉴别‘牡丹茶’滇山茶品种的分子特异性标记引物及鉴定方法；所述引物序列为上游引物：5'‑ATCGCCAACAGAAACAACACGC‑3'；下游引物：5'‑ATTCACATCTAATGAGCGAAGGTTG‑3'。利用本发明开发的分子特异性标记引物能对‘牡丹茶’滇山茶品种与其它滇山茶主要栽培品种进行快速、准确的分子鉴定，尤其适合对未到花期植株的滇山茶品种的早期鉴定，以及形态特征相似的品种进行鉴别。

技术研发人员：郑伟,颜成敏,徐晓丹
受保护的技术使用者：昆明理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12