具有IDO1抑制功能的1,2,3-三氮唑类化合物及其制备方法

本发明属于具有免疫抑制的抗肿瘤药物研究领域，具体涉及一种具有ido1抑制功能的1,2,3-三氮唑类化合物及其制备方法。

背景技术：

1、癌症是仅次于心血管疾病的全球第二大死亡原因，虽然已经有许多有效的抗癌治疗方法，但由于其副作用，如对抗癌药物的耐药性、癌细胞和非癌细胞的不区分、放疗的限制和手术的要求，需要采用不同机制的有效替代方法来治疗。尽管抗癌药物的开发取得了进展，但仍需要开发更有效和更安全的抗癌药物，因为目前的抗癌药物会引起不必要的副作用，并且许多患者已经产生耐药性。杂环在抗癌药物的发现中发挥了非常重要的作用。1,2,3-三唑是药物化学中重要的杂环化合物，其衍生物具有良好的抗癌活性。该类化合物很稳定，其可以与生物靶标形成氢键相互作用、π-π相互作用、配位相互作用。此外，据报道，1,2,3-三唑衍生物具有多种药理特性，如抗癌、抗菌、抗炎症、抗疟疾、抗结核、抗hiv和抗病毒作用。由于其显着的生物学潜力，在抗癌剂开发的药物发现中受到了相当大的关注。

2、肿瘤免疫治疗被认为是近年来肿瘤治疗的又一亮点。吲哚胺2,3-双加氧酶1(ido1)是人体肝脏外催化色氨酸沿犬尿氨酸途径代谢的起始和限速酶。ido1被认为是一种真正的免疫调节剂，不仅在妊娠期，而且在自身免疫性疾病、慢性炎症和肿瘤免疫中也是如此。在过去的几年里，包括结构、生物学和功能性证据在内的大量新信息已经浮出水面[9]。ido1在致病性炎症过程中起作用并产生对肿瘤抗原的免疫耐受。ido1可以促进色氨酸消耗并产生一系列有毒的犬尿氨酸代谢物，通过激活gcn2通路、抑制mtor通路、犬尿氨酸的毒性作用以及促进调节性t细胞(treg)分化来达到免疫耐受。目前已经发现多种肿瘤组织中过表达ido1。因此，ido1成为研究肿瘤免疫抑制剂的潜在靶点。此外，已经进行的临床前和临床试验也表明ido1抑制剂似乎有望成为可以对抗多种癌症的有效药物。

3、本发明利用1,2,3-三氮唑环能够与金属离子配位的能力，其中三唑的n原子与血红素亚铁之间可形成配位相互作用，设计了一批含有三氮唑的新型化合物。

技术实现思路

1、本发明所述的1,2,3-三氮唑类化合物分子的制备方法，其特征在于该1,2,3-三氮唑药物分子结构为：其中r1为甲酰基化合物或苯磺酰基化合物等；r2为r3为苯基衍生物或苄基衍生物或杂环衍生物；r4和r5为苯基衍生物或苄基衍生物或杂环衍生物。

2、本发明所述的1,2,3-三氮唑类化合物的制备方法，其特征在于：

3、(1)、向反应瓶中依次加入一定量的炔基苯胺类化合物和三乙胺，向体系中加入二氯甲烷，在冰水浴下搅拌一段时间后使其完全溶解并降温到5℃以下。并在此温度下利用恒压滴液漏斗将酰氯化合物溶解于适量二氯甲烷后的溶液缓慢滴入反应体系中；保持冰水浴搅拌，通过tlc检测反应完毕之后，冷却至室温，将反应液分批次转移至分液漏斗，用饱和食盐水萃取多次，收集上层有机相，并向其中加入无水硫酸钠，充分搅拌后静置一段时间，过滤除去无水硫酸钠，在35℃下，利用旋转蒸发仪减压蒸馏除去有机溶剂二氯甲烷，然后通过柱层析将得到的粗产物进行分离纯化(pe:ea＝4:1v/v，层析柱填充硅胶)，最终得到酰胺炔类化合物；所述的炔基苯胺类化合物为3-乙炔基苯胺，2-乙炔基苯胺或4-乙炔基苯胺；所述的酰氯化合物为3,4-二甲氧基苯甲酰氯，或3,4,5-三甲氧基苯甲酰氯或苯磺酰氯类化合物；所述的炔基苯胺类化合物与三乙胺与酰氯化合物的投料量摩尔比为1：1：1。

4、(2)、取一定量的酰胺炔类化合物和叠氮类化合物和l-抗坏血酸钠和无水cuso4加入到装有搅拌子的圆底烧瓶中，随后向烧瓶中加入水：叔丁醇：thf＝1:1:1(v/v/v)的混合溶剂，室温搅拌一段时间，使其全部溶解；保持室温，搅拌反应至tlc检测反应完毕之后，在漏斗中铺设硅藻土，减压抽滤，除去固体杂质。收集滤液，转移至分液漏斗，用二氯甲烷萃取多次，收集下层有机相。再用饱和食盐水反萃取多次，收集下层有机相，向其中加入无水硫酸钠，充分搅拌后静置之后过滤除去无水硫酸钠；在35℃下减压蒸馏除去二氯甲烷等有机溶剂得粗品，然后通过柱层析将得到的粗产物进行分离纯化(dcm:meoh＝500:1v/v，层析柱填充中性-al2o3)，最终得到白色固体；所述的酰胺炔类化合物与叠氮类化合物的投料量摩尔比为1：1～1.5；所述的酰胺炔类化合物与l-抗坏血酸钠与无水cuso4的投料量摩尔比为1：1～1.5：0.5～1。

5、(3)、选择ido1高表达的hela细胞作为实验对象，把得到的化合物配置成梯度浓度溶液作用到hela细胞24h，检测ido1的表达量。

6、(4)、选择hela细胞和caco-2，通过cck-8法测得化合物对这两种细胞48h的抑制效果。

7、本发明所述的1,2,3-三氮唑类化合物在制备免疫抑制药物中的应用。

8、本发明的技术优势：

9、1，本发明得到了一系列结构新颖的含有1,2,3-三氮唑的化合物；

10、2，该类化合物对hela细胞毒性很小，说明该类化合物不是通过抑制hela细胞生理功能而影响hela细胞内ido1的表达。

11、3，该类化合物对ido1具有良好的抑制作用，1,2,3-三氮唑结构能够与血红素中的fe离子形成比较强烈的作用效果，竞争性地抑制ido1的活性，带有甲氧基取代基的苯基结构可以进入亲水性口袋，苄基结构可以进入疏水性口袋，化合物分子可以很好的与ido1靶点口袋相结合，进一步证明该类化合物是设计合理的ido1抑制剂。

技术特征：

1.一种具有ido1抑制功能的1,2,3-三氮唑类化合物及其制备方法，其特征在于该1,2,3-三氮唑类化合物结构为：其中r1为甲酰基化合物或苯磺酰基化合物等；r2为r3为苯基衍生物或苄基衍生物或杂环衍生物；r4和r5为苯基衍生物或苄基衍生物或杂环衍生物。

2.根据权利要求1所述的1,2,3-三氮唑类化合物的制备方法，其特征在于该喹啉胺类药物分子的具体制备步骤为：

3.根据权利要求2所述的1,2,3-三氮唑类化合物的制备方法，其特征在于：步骤(1)为：向反应瓶中依次加入一定量的炔基苯胺类化合物和三乙胺，向体系中加入二氯甲烷，在冰水浴下搅拌一段时间后使其完全溶解并降温到5℃以下。并在此温度下利用恒压滴液漏斗将酰氯化合物溶解于适量二氯甲烷后的溶液缓慢滴入反应体系中；保持冰水浴搅拌，通过tlc检测反应完毕之后，冷却至室温，将反应液分批次转移至分液漏斗，用饱和食盐水萃取多次，收集上层有机相，并向其中加入无水硫酸钠，充分搅拌后静置一段时间，过滤除去无水硫酸钠，在35℃下，利用旋转蒸发仪减压蒸馏除去有机溶剂二氯甲烷，然后通过柱层析将得到的粗产物进行分离纯化，最终得到酰胺炔类化合物；所述的炔基苯胺类化合物为3-乙炔基苯胺，2-乙炔基苯胺或4-乙炔基苯胺；所述的酰氯化合物为3,4-二甲氧基苯甲酰氯，或3,4,5-三甲氧基苯甲酰氯或苯磺酰氯类化合物；所述的炔基苯胺类化合物与三乙胺与酰氯化合物的投料量摩尔比为1：1：1；所述的柱层析分离体系为硅胶；所述的洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯，体积比为4：1。

4.根据权利要求2所述的1,2,3-三氮唑类化合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)为：取一定量的酰胺炔类化合物和叠氮类化合物和l-抗坏血酸钠和无水cuso4加入到装有搅拌子的圆底烧瓶中，随后向烧瓶中加入水和叔丁醇和thf体积比为1:1:1的混合溶剂，室温搅拌一段时间，使其全部溶解；保持室温，搅拌反应至tlc检测反应完毕之后，在漏斗中铺设硅藻土，减压抽滤，除去固体杂质。收集滤液，转移至分液漏斗，用二氯甲烷萃取多次，收集下层有机相。再用饱和食盐水反萃取多次，收集下层有机相，向其中加入无水硫酸钠，充分搅拌后静置之后过滤除去无水硫酸钠；在35℃下减压蒸馏除去二氯甲烷等有机溶剂得粗品，然后通过柱层析将得到的粗产物进行分离纯化，最终得到白色固体；所述的酰胺炔类化合物与叠氮类化合物的投料量摩尔比为1：1～1.5；所述的酰胺炔类化合物与l-抗坏血酸钠与无水cuso4的投料量摩尔比为1：1～1.5：0.5～1；所述的柱层析分离体系为al2o3；所述的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，体积比为500：1。

5.根据权利要求1所述的1,2,3-三氮唑类化合物在针对ido1酶活的抑制功能中的应用。

6.根据权利要求5所述的实验方法，具体用到的材料：hela细胞，dmem培养基，胎牛血清，双抗(青霉素-链霉素)，高纯水，dmso，人类干扰素ifn-γ，3.05n三氯乙酸，对二甲氨基苯甲醛，乙酸。

7.根据权利要求5所述的实验方法，具体操作方法：1、药物稀释：药物稀释用的都是含有0.1％dmso的培养基，因此dmso的最终浓度在所有处理中都是0.1％；2、细胞培养基配方：dmem培养基，10％胎牛血清，1％双抗；3、检测方法：在96孔板中加入100μl含有hela细胞的培养基，50,000细胞/孔；细胞在37℃，5％co2培养24h；次日每孔加入100μl含有抑制剂和人类干扰素ifn-γ的培养基，使干扰素的终浓度为100ng/ml；细胞在37℃的co2培养箱中孵育24h，ido1将甲酰犬尿氨酸水解为犬尿氨酸；次日取出140μl培养基至新的96孔板中，并在每孔加入20μl3.05n的三氯乙酸。96孔板在50℃孵育30min；96孔板用离心机2500rpm离心10min，每孔取100μl上清液转移至新的96孔板中，每孔加入100μl2％(w/v)的对二甲氨基苯甲醛(乙酸为溶剂)；96孔板在室温孵育10min，用酶标仪检测od480；4、数据处理：该实验的每个浓度做3个平行实验；用graphpad prism对吸光度的数据进行分析；没有药物处理但含有100ng/ml ifn-γ的作为100％(at)；只有培养基的空白实验作为0％(ab)。根据下面的方程计算每个药物处理时的吸光度：吸光度％＝(a-ab)/(at-ab)，a:药物处理+100ng/mlifn-γ，ab：空白对照，at：没有药物处理但含有100ng/ml ifn-γ；用吸光度％的值与不同药物浓度的值做出非线性回归的反曲s形剂量反应曲线，回归方程是：y＝b+(t-b)/1+10((logec50-x)×hill slope)，y＝吸光度％，b＝最小吸光度％，t＝最大吸光度％，x＝log药物浓度，hill slope＝斜率(hill系数)；所述的抑制剂加药浓度为0.0001～250μm。

8.根据权利要求1所述的1,2,3-三氮唑类化合物在针对hela细胞和caco-2细胞抑制功能中的应用。

技术总结
本发明公开了一种具有IDO1抑制功能的1,2,3‑三氮唑类化合物及其制备方法，属于抗肿瘤药物研究领域。本发明的技术方案要点为：以4‑苯基‑1,2,3‑三氮唑为母核，利用现代药物设计方法，设计、合成目标化合物。全部化合物经过酶抑制活性检测，结果显示20个化合物对IDO1靶点具有良好的抑制效果。

技术研发人员：李月明,吴琼,王欣,毛龙飞,汪贞贞,龚晓庆,赵杰,侯延生
受保护的技术使用者：南开大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12