一种利用芽孢杆菌抑制虾蟹养殖中致病菌群体感应的物质获取方法

1.本发明涉及淡水养殖领域，特别是涉及一种利用虾蟹养殖环境中分离获得的芽孢杆菌抑制致病菌群体感应的物质获取新方法。


背景技术：

2.我国稻虾综合种养发展迅速，2020年全国种养面积1892.03万亩，克氏原螯虾产量为239万吨，总产值达4000亿元以上；河蟹养殖业是江苏省最具代表性和最有影响力的渔业支柱性产业，年产量约40万吨，约占全国总产量的一半。每年虾蟹养殖业因病害造成的损失高达几十亿元，其中细菌性病害发病率高达57.63％，严重影响了其健康、稳定的发展。利用抗生素防治细菌性疾病，存在细菌易产生耐药性、药物残留、环境污染等诸多问题，抗生素已逐渐退出水产养殖业的生产过程。因此，寻找环境友好且易于操作的防治虾蟹细菌性病害新方法刻不容缓。群体感应是细菌之间交流的一种特殊机制，许多致病菌致病因子的产生都受到群体感应系统的直接或间接调控，抑制群体感应系统只抑制致病菌的致病行为，不影响细菌的生长，从而避免了耐药突变菌株的出现，无药物残留及环境污染等问题，是当前热点研究方向，可以作为探索防治虾蟹细菌性病害新方法的切入点。


技术实现要素：

3.本发明针对背景技术，从河蟹、克氏原螯虾混养池塘环境中分离得到一株具有群体感应功能的芽孢杆菌，以lb培养基为基础，采用a136液体x-gal法探究不同发酵条件及培养基成分对菌株降解信号分子c6-hsl 能力的影响，利用单因素试验的方法，分别对发酵时间、起始ph值、蛋白胨、酵母粉、盐度等主要培养参数进行优化，形成一种利用芽孢杆菌抑制虾蟹致病菌群体感应的物质获取方法。
4.为实现上述目的，本发明技术解决方案如下：
5.一种利用芽孢杆菌抑制虾蟹致病菌群体感应的物质获取方法，包括以下步骤：
6.(1)利用lb培养基活化芽孢杆菌菌种，准确称量lb培养基，溶化后调节ph值至7.0-7.5，进行灭菌，然后接种芽孢杆菌，在28℃，180r
·
min-1
的条件下培养24h；
7.(2)利用lb培养基作为基础，调节起始ph值至7.0-7.5，调整蛋白胨浓度2.0％，酵母粉浓度为0.75％，盐度至6，作为芽孢杆菌抑制虾蟹养殖中致病菌群体感应的物质制备发酵用培养基；
8.(3)将培养24h的活化后芽孢杆菌菌液，按照6％的接种量，接种于发酵液；
9.(4)在28℃，180r
·
min-1的条件下培养48h，此时发酵液中芽孢杆菌抑制虾蟹养殖中致病菌群体感应的物质含量最高。
10.进一步地，所述步骤(1)中灭菌工序采用加塞包扎后于121℃高压灭菌锅中20min灭菌。
11.优选地，所述步骤(2)中调节起始ph值至7.0。
12.对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
13.本发明通过对具有抑制虾蟹养殖中细菌性致病菌群体感应功能的芽孢杆菌进行培养，获取具有抑制群体感应功能的物质，该物质只抑制致病菌的致病行为，不影响细菌的生长，从而避免了耐药突变菌株的出现，实现了无药物残留及环境污染等。本方法既可以有效降低细菌性病害致病性，又不污染环境，具有极大的推广价值。
附图说明
14.图1为本发明起始ph实验图。
15.图2为本发明蛋白胨浓度实验图。
16.图3为本发明酵母粉浓度实验图。
17.图4为本发明发酵盐度实验图。
18.图5为本发明发酵时间实验图。
具体实施方式
19.为更进一步阐述本发明为实现预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合较佳实施例，对依据本发明的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。
20.采用a136液体x-gal法探究不同发酵条件及培养基成分对菌株降解信号分子c6-hsl能力的影响，利用单因素试验的方法，分别对发酵时间、起始ph值、蛋白胨、酵母粉、盐度等主要培养参数进行优化实验。
21.1、如图1所示，保持其他参数一致，设置5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、 8.0等6个起始ph，确定最适宜的起始ph。
22.2、如图2所示，保持发酵条件及培养基的其他成分不变，设置0％、 0.5％、1.0％、1.5％、2％、2.5％的蛋白胨含量，确定最适宜的蛋白胨浓度。
23.3、如图3所示，保持发酵条件及培养基的其他成分不变，设置0％、 0.25％、0.50％、0.75％、1.00％、1.25％的酵母粉含量，确定最适宜的酵母粉浓度。
24.4、如图4所示，保持其他发酵参数不变，培养基中nacl的千分含量作为盐度，设置0、2、4、6、8、10共计六个梯度，确定最适宜发酵的盐度。
25.5、如图5所示，保持其他参数一致的情况下，设置12h，24h，36h， 48h，60h，72h的发酵时间，探究菌株产功能物质的最适发酵时间。
26.通过以上实验，本发明最终研发了以下利用芽孢杆菌抑制虾蟹致病菌群体感应的物质获取方法：
27.首先，利用lb培养基活化芽孢杆菌菌种。准确称量lb培养基，溶化后调节ph值至7.0，加塞包扎后于121℃高压灭菌锅中20min灭菌；接种芽孢杆菌，在28℃，180r
·
min-1的条件下培养24h。
28.然就，利用lb培养基作为基础，调节起始ph值至7.0，调整蛋白胨浓度2.0％，酵母粉浓度为0.75％，盐度至6。将培养24h的活化后芽孢杆菌菌液，按照6％的接种量，接种于发酵液。
29.最后，在28℃，180r
·
min-1的条件下培养48h，此时发酵液中芽孢杆菌抑制虾蟹养殖中致病菌群体感应的物质含量最高。
30.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简介修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。


技术特征：
1.一种利用芽孢杆菌抑制虾蟹致病菌群体感应的物质获取方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)利用lb培养基活化芽孢杆菌菌种，准确称量lb培养基，溶化后调节ph值至7.0-7.5，进行灭菌，然后接种芽孢杆菌，在28℃，180r
·
min-1
的条件下培养24h；(2)利用lb培养基作为基础，调节起始ph值至7.0-7.5，调整蛋白胨浓度2.0％，酵母粉浓度为0.75％，盐度至6，作为芽孢杆菌抑制虾蟹养殖中致病菌群体感应的物质制备发酵用培养基；(3)将培养24h的活化后芽孢杆菌菌液，按照6％的接种量，接种于发酵液；(4)在28℃，180r
·
min-1的条件下培养48h，此时发酵液中芽孢杆菌抑制虾蟹养殖中致病菌群体感应的物质含量最高。2.如权利要求1所述的一种利用芽孢杆菌抑制虾蟹致病菌群体感应的物质获取方法，其特征在于：所述步骤(1)中灭菌工序采用加塞包扎后于121℃高压灭菌锅中20min灭菌。3.如权利要求1所述的一种利用芽孢杆菌抑制虾蟹致病菌群体感应的物质获取方法，其特征在于：所述步骤(2)中调节起始ph值至7.0。

技术总结
本发明涉及一种以LB培养基为基础，采用A136液体X-gal法探究不同发酵条件及培养基成分对菌株降解信号分子C6-HSL能力的影响，利用单因素试验的方法，分别对发酵时间、起始pH值、蛋白胨、酵母粉、盐度等主要培养参数进行优化，形成一种利用芽孢杆菌抑制虾蟹致病菌群体感应的物质获取方法。本发明通过对具有抑制虾蟹养殖中细菌性致病菌群体感应功能的芽孢杆菌进行培养，获取具有抑制群体感应功能的物质，该物质只抑制致病菌的致病行为，不影响细菌的生长，从而避免了耐药突变菌株的出现，实现了无药物残留及环境污染等。本方法既可以有效降低细菌性病害致病性，又不污染环境，具有极大的推广价值。的推广价值。


技术研发人员：叶建勇 王信海 王宣朋 张高伟 王腾 单金峰 吴春
受保护的技术使用者：江苏省农业科学院宿迁农科所
技术研发日：2022.04.28
技术公布日：2022/8/12