可分泌和高产果糖的聚球藻YD03及其制备方法

本发明涉及合成生物学领域，更特别地，涉及一种具有果糖分泌能力和高果糖产量的聚球藻yd03及其制备方法。

背景技术：

1、果糖在食品、医药以及化工等行业广泛应用，尤其可用于对糖尿病、肥胖症、龋齿等疾病的预防。目前，市场上的果糖产品有果葡糖浆、结晶果糖两种形式。果葡糖浆的生产是以淀粉为主要原料，通过化学催化合成路线，首先利用α-淀粉酶和糖化酶将淀粉水解为葡萄糖，再利用葡萄糖异构酶，将葡萄糖转化为含有42％果糖和58％葡萄糖的果葡糖浆。结晶果糖(纯度大于97％的果糖)，是细小的粉末状晶体，其生产也是以果葡糖浆为基础，从葡萄糖-果糖混合体系中进行产物提取，需经过色谱分离、富集、浓缩、结晶、筛分等一系列操作进行制备，生产工艺繁琐复杂、转化率较低、耗粮较大，且对设备要求较高。因此，开发高效、绿色的新型果糖合成技术对于降低果糖产业的经济和环境成本，提高产品竞争力和市场接受度具有重要意义。

2、蓝细菌是一类进行植物型放氧光合作用的原核微生物，相较于微藻和高等植物，蓝细菌具有结构简单、生长迅速、遗传改造便捷等优势，因此成为极具潜力的生物能源和生物基化学品光合合成平台。但是，目前研究中尚未发现有潜力的高果糖含量蓝细菌，也没有发现蓝细菌具有向外分泌果糖的能力。niederholtmeyer等通过向聚球藻pcc7942中转入己糖转运蛋白glf基因，形成果糖分泌通路，使得该菌能够向外分泌果糖，但是即便在最优条件下，其产生的胞外果糖含量最高只有28.8mg/l，且果糖水平随着细胞密度的增加而下降，达不到工业化生产的要求(niederholtmeyer,h.,wolfstadter,b.t.,savage,d.f.,silver,p.a.,and way,j.c.,engineering cyanobacteria to synthesize and exporthydrophilic products.appl.environ.microbiol.,2010.76(11):p.3462-3466)。

3、因此，需要一种新的具有高果糖产量并将果糖分泌到细胞外的蓝细菌。

技术实现思路

1、我们在对聚球藻pcc7002的研究过程中发现，当该藻的果糖激酶被敲除后，突变株出乎意料地表现出极高的果糖产量，并且这些果糖基本上均被分泌到胞外，使得培养体系中果糖含量高达数百毫克每升。在此基础上，我们进行了进一步的代谢工程改造该藻，得到了一株具有超高果糖产量的工程藻株yd03。

2、基于上述工作，本发明提供了一种制备具有果糖分泌能力和高果糖产量的聚球藻的方法，以聚球藻pcc7002为出发藻株，敲除所述出发藻株的果糖激酶。优选地，还敲除了磷酸甘油葡糖苷合酶，并在所述出发藻株中过表达蔗糖水解酶、蔗糖磷酸合酶和蔗糖磷酸磷酸化酶。通过敲除果糖激酶，可使聚球藻pcc7002具备高产果糖并将果糖转运至胞外的能力，通过过表达蔗糖水解酶、蔗糖磷酸合酶和蔗糖磷酸磷酸化酶并敲除磷酸甘油葡糖苷合酶，可大幅提高工程藻株的果糖产量。

3、在一个具体实施方案中，所述果糖激酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。

4、在一个具体实施方案中，所述磷酸甘油葡糖苷合酶的氨基酸序列如seq id no.3所示。

5、在一个具体实施方案中，所述蔗糖水解酶的氨基酸序列如seq id no.6所示。

6、在一个具体实施方案中，所述蔗糖磷酸合酶的氨基酸序列如seq id no.8所示。

7、在一个具体实施方案中，所述蔗糖磷酸磷酸化酶的氨基酸序列如seq id no.10所示。

8、以上几个具体实施方案中，虽然列出了蔗糖水解酶、蔗糖磷酸合酶和蔗糖磷酸磷酸化酶的具体的氨基酸序列和核酸序列，但是，本领域技术人员在阅读了本申请的内容并在领会本申请的精神后，可在现有和将有的基因库里面选择适宜的氨基酸或核酸序列，用于在藻株中过表达，以提高藻株的果糖产量和产率。

9、在一个具体实施方案中，上述基因的过表达通过强启动子驱动，形成基因表达框。强启动子可在现有或将有的启动子库里面进行选择，只需要选择的启动子可在pcc7002细胞中进行强表达即可。例如，启动子可选择cpcb1启动子、cpcb560启动子、rbcl启动子等组成型强启动子，也可选择lac启动子、trc启动子等诱导型强启动子。

10、上述基因表达框可插入到pcc7002的基因组dna中，例如，可插入到一些功能基因中或插入到无功能的中性平台(是指从基因组中鉴定的一些插入或缺失突变后不产生任何表型的位点)中。上述基因表达框也可以独立的可复制形式存在，例如，存在于在pcc7002中的可复制的质粒上。上述基因表达框可分别构成独立的操纵子，也可在一个操纵子下形成多顺反子。

11、本发明还提供了一种通过上述方法制备的具有果糖分泌能力和高果糖产量的聚球藻。

12、本发明还提供了一种使用上述聚球藻生产果糖的方法。

13、在一个优选实施方案中，培养所述聚球藻的培养基优选为mad2培养基。在我们的研究过程中，mad2培养基不仅具有较好的藻类培养效果，我们还意外地发现，该培养基能够比其他培养基导致显著更高的果糖产量。

14、在一个具体实施方案中，培养条件如下：培养温度为25-35℃，光照为200-350μmolphotons m-2s-1，通气培养，通入的气体为co2与空气的混合气体。

15、本发明以聚球藻pcc7002为出发藻株构建了一株具有高果糖产量的工程藻yd03。该藻株在培养一定时间后，最高可在培养物中产生6.3g/l的果糖含量，在培养体系中果糖占总糖的99.48％,纯度极高。并且由于果糖基本均被分泌到细胞外，可更容易地实现从培养物中提取果糖。因此，本发明实现了在单平台上以太阳能为驱动将二氧化碳和水直接转化为果糖，同时达到固碳减排和生产果糖的效果，提升了蓝细菌光驱固碳产糖技术的工程化应用潜力。

技术特征：

1.一种制备具有果糖分泌能力和高果糖产量的聚球藻的方法，其特征在于，以聚球藻pcc7002为出发藻株，敲除所述出发藻株的果糖激酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述果糖激酶的氨基酸序列如seq idno.1所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还敲除了所述出发藻株中的磷酸甘油葡糖苷合酶，所述磷酸甘油葡糖苷合酶的氨基酸序列如seq id no.3所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还在所述出发藻株中过表达蔗糖水解酶，所述蔗糖水解酶的氨基酸序列如seq id no.6所示。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还在所述出发藻株中过表达蔗糖磷酸合酶，所述蔗糖磷酸合酶的氨基酸序列如seq id no.8所示。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还在所述出发藻株中过表达蔗糖磷酸磷酸化酶，所述蔗糖磷酸磷酸化酶的氨基酸序列如seq id no.10所示。

7.一种具有果糖分泌能力和高果糖产量的聚球藻，其特征在于，通过权利要求1-6中任一项的方法制备得到。

8.一种生产果糖的方法，其特征在于，包括培养权利要求7所述的聚球藻并使所述聚球藻生产果糖的步骤。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，培养所述聚球藻的培养基为mad2培养基。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述聚球藻的培养条件为：培养温度为25-35℃，光照为200-350μmol photons m-2s-1，通气培养，通入的气体为co2与空气的混合气体。

技术总结
本发明涉及一种具有果糖分泌能力和高果糖产量的聚球藻YD03，以PCC7002为出发藻株，敲除果糖激酶和磷酸甘油葡糖苷合酶，并过表达蔗糖水解酶、蔗糖磷酸合酶和蔗糖磷酸磷酸化酶。通过敲除果糖激酶，可使藻株具备高产果糖并将果糖转运至胞外的能力，通过进一步的遗传改造，可大幅提高工程藻株的果糖产量。在培养一定时间后，最高可在培养体系中产生6.3g/L的果糖含量。并且由于果糖基本被分泌到细胞外，可更容易地实现从培养液中提取果糖。因此，本发明实现了在单平台上以太阳能为驱动将二氧化碳和水直接转化为果糖，同时达到固碳减排和生产果糖的效果，提升了蓝细菌光驱固碳产糖技术的工程化应用潜力。

技术研发人员：吕雪峰,孙佳慧,但玉
受保护的技术使用者：中国科学院青岛生物能源与过程研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13