一种DNA序列、表达载体及应用的制作方法

(一)本发明涉及一种dna序列、表达载体及应用。

背景技术：

0、(二)背景技术

1、在植物转基因技术中，外源基因的表达要经过转录、转录后加工、转译及转译后加工等一系列步骤，并且在特定的时间和空间产生特定的氨基酸序列。通过对基因表达的不同阶段进行调控可以控制基因表达方式和表达水平。在这些调控方式中，除基因本身的特点之外，其两端的表达调控序列，尤其是5’端的启动子序列以及基因3’端非编码序列(终止子序列)往往对基因的表达有强烈的影响。

2、转录终止子位于基因或操纵子的下游，负责rna聚合酶的解离和释放出转录的rna从而起到终止转录的一段rna序列。在真核细胞中，前体mrna(pre-mrna)在转录后需要经过进一步加工后才能形成有转译活性的mrna，在此过程中mrna3’末端往往加上由25-250个核苷酸残基poly(a)组成的尾部，此过程主要由基因3’端非编码区域一段核苷酸序列决定的，这一区域称之为3’端加工信号(3’-processing signal)或终止子(terminator)。

3、之前，对于终止子的研究主要集中在预测和鉴定方面，而终止子在调节基因表达或者遗传线路中的作用，近几年才受到关注。终止子不仅可以阻止转录通读，而且对提高上游mrna的稳定性都有重要贡献。然而，迄今为止，大多数终止子调控元件研究主要集中在微生物中，只有一小部分文献提及在植物中的应用。

4、终止子虽然不具有增强子的功能，但不同来源的植物终止子对于外源的表达有着非常不同的影响。文献报道表明，不同来源的3’端序列对于npt-ii酶在转化烟草细胞内的表达水平有强烈影响，最高可达相差60倍。

5、目前转基因工程中最常用的终止子为胭脂碱合成酶(nos)终止子(t-nos)、(camv)的35s终止子等，但是在构建多基因过表达载体时，备选终止子还太少，终止子效率也亟待提高，因此发掘新型高效终止子非常重要。

技术实现思路

0、(三)
技术实现要素：

1、本发明目的是提供一种dna序列、表达载体及应用，该dna序列作为终止子能够显著提高目标基因特别是cp4基因在植物中的表达量，具有较大的潜在应用价值。

2、本发明采用的技术方案是：

3、本发明提供一种dna序列，所述dna序列具有seq id no.1所示核苷酸序列或其互补序列90％以上同一性，优选dna序列的核苷酸序列如seq id no.1所示。

4、由于核苷酸序列的特殊性，seq id no.1的核苷酸序列中有一个或多个碱基缺失、取代或加入，并且与seq id no.1所示核苷酸序列中由319个或更多碱基组成的任何区域核苷酸序列同一性超过90％的核苷酸序列均属于本发明保护范围。所述一个或多个碱基缺失、取代或加入，是指不多于10％的碱基缺失、取代、或加入。

5、本发明所述dna序列还包括在高严谨条件下可与seq id no.1所示的dna序列杂交的核苷酸序列。上述高严谨条件可为在杂交液中60℃下杂交，并在0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在60℃下洗膜。

6、本发明还提供一种含所述dna序列的表达载体，所述表达载体包括目的基因、所述dna序列，所述表达载体以pcambia1300(购自vwr公司，ncbi序列号：af234296)作为基础载体，所述dna序列连接在目的基因的3’端。

7、本发明还提供一种含所述表达载体的人工导入细胞系、宿主菌或植物细胞。

8、本发明还提供一种所述dna序列作为终止子在提高目标基因表达效率中的应用。所述应用是将dna序列作为终止子构建含目标基因的表达载体，再将表达载体转化植物宿主的细胞或组织，并将转化的组织培育成植株，提高目的基因的表达效率。

9、本发明dna序列作为终止子构建表达载体时，其序列前可加上任何一种启动子序列和目标基因序列；所述目标基因包含耐草甘膦抗性基因cp4、抗虫基因cry1ab、抗除草剂基因bar、编辑基因cas9等；所述目标基因的启动子包含花椰菜花叶病毒camv的35s启动子、玉米ubi启动子和水稻act1启动子等。所述表达载体转化植物细胞或组织，可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法。

10、所述植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，其中，单子叶植物可为草坪草、小麦、大麦、燕麦、高粱、水稻或玉米等，双子叶植物可为马铃薯、烟草、棉花、莴苣、番茄、甜瓜、大豆、油菜、桑树、豇豆、黄瓜、豌豆、甜菜或向日葵等。

11、与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明提供一种新的dna序列，该dna序列对目的基因的表达有增强作用，与常用终止子t-nos相比，目的基因表达量提高50％以上。该dna序列作为终止子在目的基因过表达方面具有非常大的潜在应用价值。

技术特征：

1.一种dna序列，其特征在于，所述dna序列具有seq id no.1所示核苷酸序列或其互补序列90％以上同一性。

2.如权利要求1所述的dna序列，其特征在于，所述dna序列的核苷酸序列如seq idno.1所示。

3.一种含权利要求1所述dna序列的表达载体。

4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括目标基因、所述dna序列；所述表达载体以pcambia1300作为基础载体，所述dna序列连接在目标基因的3’端。

5.一种包含权利要求3所述表达载体的植物细胞。

6.一种权利要求1所述dna序列作为终止子在提高目标基因表达效率中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用是将dna序列作为终止子构建含目标基因的表达载体，再将表达载体转化植物宿主的细胞或组织，并将转化的组织培育成植株，提高目标基因的表达效率。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述目标基因包含耐草甘膦抗性基因cp4、抗虫基因cry1ab、抗除草剂基因bar或编辑基因cas9；所述目标基因的启动子包含花椰菜花叶病毒camv的35s启动子、玉米ubi启动子或水稻act1启动子。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述植物包括烟草、玉米或大豆。

技术总结
本发明公开了一种DNA序列、表达载体及其作为终止子在目标基因表达中的应用，所述DNA序列具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或其互补序列90％以上同一性。本发明提供一种新的DNA序列，该DNA序列对目的基因的表达有增强作用，与常用终止子T‑nos相比，目的基因表达量提高50％以上。该DNA序列作为终止子在目的基因过表达方面具有非常大的潜在应用价值。

技术研发人员：王东芳
受保护的技术使用者：杭州芳韵生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16