体外三维表皮模型及其制备方法与流程

本发明属于三维细胞培养组织，具体涉及一种体外三维表皮模型及其制备方法。

背景技术：

1、在生物医学研究领域中，针对皮肤洗护、接触物、护肤用品等的安全性评价一直采用动物实验为主要研究、验证模型。由于种间差异，实验动物无法精确复制人类皮肤表现出的复杂生物学、生理学特征，使实验结果存在偏差和片面性，甚至得出错误结论。且随着欧洲禁止动物化妆品测试政策的出台，各国纷纷在人工皮肤替代产品方向加大了开发力度。

2、现有技术之一的中国专利申请cn110917403a提出一种组织工程皮肤支架材料及制备方法，该组织工程皮肤支架材料由透明质酸支架和纳米纤维膜组成；所述透明质酸支架由超氧化物歧化酶脂质体负载于透明质酸多孔支架上制得；所述纳米纤维膜由壳聚糖/角蛋白混合溶液制得。虽然壳聚糖和角蛋白构成的静电纺丝支架可以帮助细胞粘附，壳聚糖可以提高表皮湿度，有利于皮肤的自主修复，角蛋白降解释放的生长因子可以起到诱导真皮层成纤维细胞分泌胶原蛋白的功能。但是其并非针对人工表皮模型，在体外培养表皮模型时，无成纤维细胞辅助分泌胶原蛋白，单纯的透明质酸、超氧化物歧化酶、壳聚糖和角蛋白无法有效模拟皮肤生长环境，支撑角质细胞的生长和角质层的形成。

3、现有技术之一的中国专利cn105734009b提出体外重组人体皮肤表皮模型及其制备方法，该制备方法由制备基质胶微粒、筛选扩增表皮干细胞、制备基底细胞层、制备棘细胞层、制备颗粒细胞层、体外重组表皮模型的成熟与角化步骤组成，该现有技术是基于transwell小室的构建技术，特别是需要使用基质胶进行包被，其技术难点在于使用特定的培养基，从而进一步增加了技术难度。

4、因此，基于上述技术问题，本发明提出一种基于胶原蛋白静电纺丝膜的体外三维表皮模型及其制备方法。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种体外三维表皮模型及其制备方法。

2、本发明的一方面，提供一种体外三维表皮模型的制备方法，具体步骤包括：

3、制备静电纺丝膜；

4、将所述静电纺丝膜贴设在预设支架内，以形成气液小室；

5、将角质细胞接种于所述气液小室内，培养预设时间段后更换培养基，并经气液界面培养以形成体外三维表皮模型。

6、进一步地，所述制备静电纺丝膜，包括：

7、提供第一组分、第二组分以及第三组分；其中，

8、所述第一组分为i型胶原蛋白；

9、所述第二组分为iii型胶原蛋白、iv型胶原蛋白、明胶、丝素蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、层黏连蛋白、多糖以及提取的细胞外基质混合物中的任一种或多种；

10、所述第三组分分选自聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸、聚己内酯、聚乙烯醇中的一种或多种；按预设比例将所述第一组分、所述第二组分以及所述第三组混合配制成静电纺丝原液，使用多孔膜接收，在预设的电纺条件下形成所述静电纺丝膜。

11、进一步地，所述第一组分、所述第二组分以及所述第三组分的比例范围为(1～5):1:(3～5)。

12、进一步地，所述多孔膜的材料包括聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚四氟乙烯中的一种，所述多孔膜的孔径范围为0.4μm～5μm，孔密度范围为1×105个/cm2～1×108个/cm2。

13、进一步地，所述将所述静电纺丝膜设置在预设支架内在皮肤模型支架底部，以形成气液小室，包括：

14、将所述静电纺丝膜切割成与皮肤模型支架大小相同的膜，将该膜贴设在皮肤模型支架底部，以形成气液小室；或者，

15、将所述静电纺丝膜切割成与所述皮肤芯片腔室大小相同的膜，将该膜组装进所述皮肤芯片中，以形成气液小室。

16、进一步地，所述皮肤模型支架或所述皮肤芯片的材料包括聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、环烯烃共聚物、环烯烃聚合物以及聚醚醚酮中任一种。

17、进一步地，所述将角质细胞接种于所述气液小室内，培养预设时间段后更换培养基，并经气液界面培养以形成体外三维表皮模型，包括：

18、按细胞浓度范围为1.0×106/ml～7.5×106/ml接种角质细胞，用相应的培养基在37℃、5％co2的条件下培养，培养1天～3天后吸弃所述静电纺丝膜上方的培养基，并将所述静电纺丝膜下方的培养基更换为相应的气液培养基，经10天～15天的气液界面培养，以得到所述体外三维表皮模型。

19、进一步地，所述角质细胞包括人原代角质形成细胞、细胞系角质形成细胞、干细胞分化所得角质形成细胞中任一种。

20、进一步地，所述形成体外三维表皮模型之后，还包括：

21、检测所述体外三维表皮模型的生长状态。

22、本发明的另一方面，提供一种体外三维表皮模型，采用前文记载的所述方法制得。

23、本发明提供一种体外三维表皮模型及其制备方法，该方法具体步骤包括：制备静电纺丝膜；将所述静电纺丝膜设置在预设支架内，以形成气液小室；将角质细胞接种于所述气液小室内，培养预设时间段后更换培养基，并经气液界面培养以形成体外三维表皮模型。本发明的制备方法绿色环保，不使用高温，能避免有机溶剂残留等问题，形成的体外三维表面模型成分与人体真皮层细胞外基质相仿，有助于角质细胞的黏附、增殖与屏障的形成，解决了现有人工膜使用前需要胶原包被的问题，以及，对培养基友好，使用自配置培养基或商用培养基即可完成三维表皮模型的构建。

技术特征：

1.一种体外三维表皮模型的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述制备静电纺丝膜，包括：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一组分、所述第二组分以及所述第三组分的比例范围为(1～5):1:(3～5)。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述多孔膜的材料包括聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚四氟乙烯中的一种，所述多孔膜的孔径范围为0.4μm～5μm，孔密度范围为1×105个/cm2～1×108个/cm2。

5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，所述将所述静电纺丝膜设置在预设支架内，以形成气液小室，包括：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述皮肤模型支架或所述皮肤芯片的材料包括聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、环烯烃共聚物、环烯烃聚合物以及聚醚醚酮中任一种。

7.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，所述将角质细胞接种于所述气液小室内，培养预设时间段后更换培养基，并经气液界面培养以形成体外三维表皮模型，包括：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述角质细胞包括人原代角质形成细胞、细胞系角质形成细胞、干细胞分化所得角质形成细胞中任一种。

9.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，所述形成体外三维表皮模型之后，还包括：

10.一种体外三维表皮模型，其特征在于，采用权利要求1至9任一项所述的方法制得。

技术总结
本发明提供一种体外三维表皮模型及其制备方法，属于三维细胞培养组织技术领域。其中，本发明的制备方法具体步骤包括：制备静电纺丝膜；将所述静电纺丝膜设置在预设支架内，以形成气液小室；将角质细胞接种于所述气液小室内，培养预设时间段后更换培养基，并经气液界面培养以形成体外三维表皮模型。本发明的制备方法绿色环保，不使用高温，能避免有机溶剂残留等问题，基于静电纺丝膜成分与人体真皮层细胞外基质相仿，有助于角质细胞的黏附、增殖与屏障的形成，使用时无需包被步骤，以及，对培养基友好，使用自配置培养基或商用培养基即可完成三维表皮模型的构建。

技术研发人员：请求不公布姓名
受保护的技术使用者：江苏艾玮得生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15