抗人嗜铬粒蛋白A(CHGA)鼠单克隆抗体及其用途的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及一种杂交瘤细胞株oti8h7分泌的单克隆抗体与人嗜铬粒蛋白a(chga)特异性结合用于免疫检测的方法和应用。

背景技术：

1、嗜铬粒蛋白a(chromogranin a)又称嗜铬素a是由chga基因编码，有457个氨基酸组成的一种可溶酸性细胞蛋白，分子量为50kda。最初在肾上腺的嗜铬粒细胞的分泌颗粒中被发现，现研究发现其在交感神经、心肌、胰腺、中枢和周围神经系统、肠道内分泌组织、甲状腺和甲状旁腺等组织中均有表达。几乎所有的神经内分泌肿瘤均可检测到嗜铬素a，阳性程度取决于致密核心颗粒的数量。抗体主要用于标记神经内分泌肿瘤，也可用于甲状腺髓样癌和滤泡癌的鉴别诊断，甲状腺髓样癌阳性，而甲状腺滤泡样癌阴性。

2、免疫组织化学(简称免疫组化，immunohistochemistry，ihc)在临床常用来做恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断、确定转移性恶性肿瘤的原发部位、肿瘤分型等。嗜铬素a的表达特征决定了它是一种良好的诊断标记物。因此，研制出一种特异性较高的针对嗜铬素a蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种与嗜铬素a蛋白特异性结合的单克隆抗体，及其在用于检测嗜铬素a蛋白的免疫检测工具中的应用。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种能分泌抗嗜铬素a蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株 oti8h7，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为 cgmcc)，保藏日期为2021年5月21日，保藏编号为cgmcc no.22346。本发明还提供了一种特异性结合嗜铬素a的单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞株 oti8h7分泌。

4、本发明所述单克隆抗体制备方法如下：

5、(1)重组表达载体的构建：基因合成嗜铬素a核苷酸序列如seq id no.1所示， orf长度为：651bp，表达嗜铬素a蛋白241-457氨基酸序列，氨基酸长度为 217aa，具体序列如seq id no.2所示。将合成的嗜铬素a的orf插入表达载体pet23a-his，构建嗜铬素a的重组表达质粒pet23a-his-rchga。

6、(2)重组嗜铬素a蛋白的表达与纯化：将构建的嗜铬素a重组表达质粒转化 e.coli细胞，裂解离心获得可溶性蛋白，经镍柱亲和层析柱纯化，获得纯化的重组嗜铬素a蛋白。

7、(3)单克隆抗体杂交瘤细胞筛选及其分泌的单克隆抗体制备：采用上述重组嗜铬素a蛋白免疫balb/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与sp2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，elisa和ihc法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗嗜铬素 a蛋白的特异性抗体杂交瘤细胞株，并进行亚型鉴定；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得抗嗜铬素a蛋白单克隆抗体。通过ihc检测方法验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。

8、经过上述方法制备后，筛选出能够分泌抗嗜铬素a蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为oti8h7，亚型鉴定为igg1，并与2021年5月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为cgmcc)，保藏编号为 cgmcc no.22346。

9、本发明还提供了由杂交瘤细胞株oti8h7分泌的单克隆抗体在制备用于检测嗜铬素a蛋白的免疫检测工具中的应用。

10、作为优选，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

11、本发明还提供一种免疫组织化学检测试剂盒，包括由杂交瘤细胞株oti8h7 分泌的抗嗜铬素a蛋白单克隆抗体，可检测组织细胞中嗜铬素a蛋白的表达状况。

12、此外，本发明还提供杂交瘤细胞株oti8h7分泌的抗嗜铬素a蛋白单克隆抗体在制备标记肿瘤细胞试剂盒中的应用。

13、作为优选，肿瘤组织包括甲状腺髓样癌、甲状腺滤泡癌和嗜铬细胞瘤组织，正常组织胰腺。

14、本发明提供了由杂交瘤细胞株oti8h7可稳定分泌的单克隆抗体，且与嗜铬素a蛋白特异性结合，显著提高了嗜铬素a蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，广泛适用于各类肿瘤中嗜铬素a蛋白的标记。

15、生物保藏信息说明

16、用于保藏分泌抗嗜铬素a蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株oti8h7的分类命名为：鼠抗人嗜铬粒蛋白a单克隆杂交瘤细胞株

17、保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

18、保藏单位简称：cgmcc

19、保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所

20、保藏日期：2021年5月21日

21、保藏编号：cgmcc no.22346

技术特征：

1.一种单克隆抗体，其特征在于：特异性结合人嗜铬粒蛋白a(chga)，这种抗体是由保藏编号为cgmcc no.22346的杂交瘤细胞株oti8h7分泌的。

2.一种杂交瘤细胞株oti8h7，其特征在于：分泌与chga蛋白特异性结合的单克隆抗体，这种杂交瘤细胞株保藏编号为cgmcc no.22346。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于检测chga蛋白的免疫检测工具中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

5.一种免疫组织化学检测试剂盒，包括权利要求1所述的单克隆抗体。

6.根据权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于标记神经内分泌细胞、肿瘤细胞与肿瘤组织试剂盒中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，所述组织包括甲状腺髓样癌、嗜铬细胞瘤和胰腺。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，公开了一种由杂交瘤细胞株OTI8H7(保藏编号为CGMCCNO.22346)分泌的抗人嗜铬粒蛋白A(CHGA)鼠单克隆抗体。本发明还涉及OTI8H7分泌的单克隆抗体在制备用于检测CHGA蛋白的免疫检测工具中的应用，包含免疫组织化学检测试剂盒与标记肿瘤试剂盒中的应用。本发明所述单克隆抗体可与CHGA蛋白特异性结合，显著提高了CHGA蛋白免疫检测的特异性和可靠性。

技术研发人员：张冉冉,任琪,王晶晶,叶露,吴召慧,W·付,张杨
受保护的技术使用者：无锡傲锐东源生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14