一种野生型IMPDHII蛋白的表达纯化方法与流程

一种野生型impdh ii蛋白的表达纯化方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种野生型impdh ii蛋白的表达纯化方法。


背景技术：

2.肌苷-5
’‑
单磷酸脱氢酶(inosine 5'-monophosphate dehydrogenase，impdh，ec1.2.1.14)是鸟嘌呤生物合成的限速酶。该酶主要与细胞增殖等相关，抑制该酶活性可抑制肿瘤细胞的增殖，因此，该酶是重要的抗肿瘤药物靶标。表达有活性的impdh可应用于其抑制的高通量筛选，有助于抗肿瘤药物的筛选以及药物的作用机制研究。
3.在人体内主要有两种亚型：impdh i和impdh ii，其中，impdh ii型特异性的分布于淋巴细胞中，抑制其活性可阻止淋巴细胞的增殖；因此其抑制剂可应用于机体免疫的调节；其抑制剂的应用包括在器官移植后的排异反应控制。表达有活性的impdh ii蛋白可应用于免疫抑制剂的筛选，有助于排异反应控制药物的筛选和该类药物的作用机制研究。
4.野生型impdh ii的核酸序列和蛋白序列已被公开报道【natsumeda,y.,et al.1990j bioz.chem.265:5292-5295；collart,f.r.and hubermann,e.1988j.biol.chem.263:15769-15772；and u.s.pat.no.5,665,583(seq id no:63)】，野生型impdh ii的表达主要依赖于原核表达系统和真核表达系统。在有活性的野生型impdh ii的表达中，原核表达系统主要用到的表达工程菌株包括：impdh缺陷型大肠杆菌h712和常规的大肠杆菌；专利ep 1 559 779 a1公开了利用impdh酶缺陷型大肠杆菌h712对impdh ii和其变体进行表达，可表达获得天然的impdh ii和其变体，但该方法要用到impdh缺陷型表达菌株e.coli h712；而常规的大肠杆菌表达野生型impdh ii，尤其是带有his标签时大都以包涵体形式存在，导致工艺复杂、蛋白活性较低，目前市售的原核表达的impdh ii绝大部分是包涵体，只能用于sds-page实验，没有生物学活性。真核表达系统主要用到hela稳转株细胞表达，市售的真核表达的impdh ii相对比活也比较低，且售价较昂贵。
5.大量生产和纯化野生型impdh ii的能力对于临床应用和研究应用也很重要，如对新的impdh ii抑制剂的识别和设计，对癌症和免疫抑制疗法以及检测impdh ii与抑制剂的灵敏度，因此急需一种表达量高、易于纯化、活性高、稳定性强、成本低的获得天然impdh ii蛋白的方法，以便推广和应用。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种表达量高、易于纯化、活性高、稳定性强、成本低的获得天然impdh ii蛋白的方法。
7.本发明公开了一种野生型impdh ii蛋白的表达纯化方法，包含下列步骤：
8.s1.克隆或合成获得含野生型impdh ii序列的重组核酸片段；
9.s2.构建重组载体，将重组载体转化至宿主细胞，得到基因工程菌；
10.s3.发酵培养：所述基因工程菌活化后，进行扩大培养，再采用自诱导培养基进行
发酵培养；
11.s4.impdh ii蛋白纯化；
12.步骤s3中所述自诱导培养基由下列组分组成：
13.α-乳糖：2g/l；葡萄糖：0.5g/l；甘油：5g/l；kh2p04：3.4g/l；
14.mgso4：0.49g/l；蛋白胨：10g/l；na2hpo
4 3.55g/l；na2so4：0.71g/l；
15.nh4cl:2.67g/l；ph 7.4。
16.现有重组蛋白大肠杆菌发酵表达中，均需要添加诱导剂，一般为itpg，才能够诱导基因工程菌中重组蛋白的表达；但是，诱导剂itpg的添加不仅成本较高，而且会造成重组蛋白的非活性表达，进而影响重组蛋白的活力。本发明采用低温自诱导方法，不仅成本低廉，解决了现有技术中impdh ii重组表达易形成包涵体的问题，而且不会造成impdh ii的非活性表达，能够显著提高impdh ii蛋白的活力。
17.在一优选实施例中，所述重组核酸片段含有his标签，其位于impdh ii核酸序列的n端，以便于后期纯化中镍亲和层析的使用；
18.在一优选实施例中，所述重组核酸片段含有tev酶剪切位点的核酸序列，其位于his标签序列和impdh ii核酸序列中间，以便于重组蛋白纯化后，通过tev酶剪his标签；
19.在一优选实施例中，所述重组核酸片段的核酸序列如seq id no.1。
20.在一优选实施例中，所述重组载体为pet-21a(+)、pet-24a(+)、pet-28a(+)、pet-30a(+)或pet-duet；
21.在一优选实施例中，所述宿主细胞为bl21(de3)或arcticexpress(de3)prare2 bl21，其中优选为arcticexpress(de3)prare2 bl21；
22.在一优选实施例中，所述自诱导培养条件为温度10-20℃，ph7-8
23.在一优选实施例中，所述自诱导培养条件为先37℃培养至菌液od
600
为3.0-4.0，然后12℃继续培养至菌液od
600
为14-19。
24.在一优选实施例中，所述步骤s4中，所述蛋白纯化步骤：
25.a.菌体称重
26.b.按照1g湿菌体加入50ml buffer a的量重悬菌体并使用均质机破碎细胞
27.c.使用akta pure蛋白纯化仪和his trap hp预装柱纯化蛋白
28.d.透析和超滤浓缩蛋白
29.所用溶液如下：
30.裂解液：50mm kh2po4,300mm kcl,20mm咪唑,0.8m尿素,ph8.0；
31.洗脱液：50mm kh2po4,300mm kcl,500mm咪唑,0.8m尿素,ph8.0；
32.透析液：50mm kh2po4,300mm kcl,1mm dtt,0.8m尿素,1mm edta,1mm pmsf,ph8.0；
33.本发明所述方法使采取低温自诱导的方式能够高效的表达带有8 x his标签，tev酶剪切位点的人野生型impdh ii蛋白,每升自诱导培养基可收获纯度达90％以上的蛋白350mg以上，比活力可达2左右，置于存储buffer中，在4℃环境中可存储14天保持活力不降。
附图说明
34.图1 pet28a-impdh ii重组质粒结构示意图。
35.图2为低温自诱导蛋白表达鉴定。
36.图中条带1为低温诱导前取样，条带2为低温诱导后取样，条带3为buffer a重悬后取样，条带4为均质机破碎后取样，条带5为均质机破碎后离心上清取样，条带6为均质机破碎后离心沉淀重悬液，条带7为均质机破碎后离心沉淀重悬液再次离心上清鉴定结果显示，低温自诱导培养条件能够高效地可溶性表达出带有8
×
his和tev酶切位点的野生型impdh ii蛋白
37.图3impdh ii蛋白低温自诱导产物的纯化结果电泳图。
38.图中条带1、2、3、4、5、6、7、8为蛋白纯化过程中的上样洗杂的流穿峰，条带9、10为500mm咪唑的洗脱峰，条带11、12为浓缩后上样的2ug，条带13、14为浓缩后上样的5ug。
具体实施方式
39.本发明所述“impdh ii”、“impdh 2”为同一物质，其的核酸序列和蛋白序列已被公开报道，见natsumeda,y.,et al.1990j bioz.chem.265:5292-5295；collart,f.r.and hubermann,e.1988j.biol.chem.263:15769-15772；and u.s.pat.no.5,665,583(seq id no:63)
40.1、重组核酸分子和宿主载体系统
41.本发明提供核酸分子，如编码野生型impdh ii的dna分子(rdna)。如本文所述，rdna分子是一种dna分子，在体外经过分子操作：产生rdna分子的方法在本技术领域中是众所周知的，如参见sambrook等人，分子克隆(1989)。
42.本发明的核酸分子可以是重组分子，每个重组分子包含野生型impdh ii核苷酸序列，例如，野生型impdh ii核苷酸序列可以连接到表达载体以生成重组表达载体；
43.术语“表达载体”(expression vectors)或重组表达载体就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、rbs、终止子等)，使目的基因能够表达的载体，包括但不限于病毒载体和非病毒载体(质粒，粘粒)。首选表达载体还包括一个表达控制元件，例如启动子序列，该元素可以启动插入的impdh核苷酸序列的转录，在适当的宿主细胞中，例如大肠杆菌，可用于调节impdh序列的表达(转录和/或翻译)。原核表达控制元件，但不限于诱导型启动子，构型启动子，分泌信号，增强子，转录终止剂和其他转录调节元件，以及与翻译有关的其他表达控制元件。
44.优选的表达载体还包括至少一个可选择标记基因，该基因编码具有耐药性的基因产物，如对氨苄西林、四环素或卡那霉素的耐药性。通常，载体还包括多个内切酶限制位点，可以方便地插入外源dna序列。
45.优先的表达载体是与原核宿主细胞兼容的表达载体。
46.本技术领域中众所周知的，原核细胞表达载体可以从多方商业来源获得，典型的载体如pet-21a(+)、pet-24a(+)、pet-28a(+)、pet-30a(+)或pet-duet表达载体，它用于表达大肠杆菌中的外源基因；
47.融合基因是重组核酸分子的另一个例子，该分子包含融合野生型impdh ii核苷酸序列，如，野生型impdh ii核苷酸序列可以融合his标签，以促进表达impdh ii的分离和/或纯化的标签序列(marshak,d.r.,et al.,1996in:strategies for protein purification and characterization pp 396)
48.本发明还提供了含有本发明公开的核酸分子的宿主细胞。本发明提供了一种宿
主-载体系统，该宿主-载体系统包括引入该载体、质粒、噬菌体或cosmi的合适宿主细胞，该宿主细胞包含编码impdh ii的核苷酸序列。
49.宿主细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞。例如，许多市售的大肠杆菌菌株对外源蛋白的表达特别有用。适合的真核寄主细胞的例子包括酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或动物细胞，如哺乳动物细胞。一种优选实施例提供了一种宿主载体系统，该宿主载体系统包括重组pet28+载体，该载体包括引入大肠杆菌bl21(de3)宿主细胞的impdh2核苷酸序列；
50.本发明的重组dna分子可以通过通常依赖所使用的载体类型和所使用的宿主系统的已知方法引入到适当的细胞宿主中。例如，通常采用电穿孔和盐处理方法转化原核宿主细胞，见，例如，cohen等人，proc acad sci usa(1972)69:2110；和maniatis等人，(1989)在:分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约。
51.所选的载体可能是用于在细菌宿主细胞中表达和生产impdh ii的表达载体。例如，直接高水平表达易于纯化的融合蛋白的载体；还可能需要特定的启动信号来有效地翻译改良的impdh ii序列。这些信号包括atg启动密码子和相邻序列
52.在一些优选实施例中，impdh ii序列包含启动密码子和上游序列被插入适当的表达载体，不需要其他翻译控制信号。但是，如果仅插入仅编码序列或部分编码序列或部分，则必须提供包括atg启动密码子在内的外源转录控制信号。此外，启动密码子必须处于正确的阅读框架中，以确保整个插入物的转录。外源转录元件和起始密码子可以具有自然和合成的各种起源。通过包含适合使用细胞系统的增强剂，可以提高表达效率
53.对于长期、高产的重组蛋白生产，稳定表达是首选。例如，稳定表达impdh ii的细胞系可以使用包含病毒复制源或内源性表达元件和可选择标记基因的表达载体进行转化。引入载体后，细胞可以在富培养基中生长1-2天，然后切换到选择性培养基。可选择标记的目的是赋予选择抗性，它的存在使细胞的生长和恢复成功；
54.任何选择系统都可以用于恢复转化的细胞系，其中包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(wigler,m.et al.,1977cell 11:223-32)和腺嘌呤磷脂蛋白基转移酶(lowy,i.et al.,1980，cell 22:817-23)分别用于tk-minus或aprt-minus细胞的基因。同样，抗代谢物，抗生素或除草剂耐药性可用作选择的基础。例如，赋予甲氨蝶呤的抗性的dhfr(wigler,m.et al.,1980proc natl acad sci 77:3567-70)；npt赋予对氨基糖苷新霉素和g-418的耐药性(colbere-garapin,f.et al.,1981 j mol biol 150:1-14)和als或als或pat，它们分别赋予对氯磺磺化和磷酸蛋白乙酰基转移酶的耐药性
55.另外的选择基因也可被考虑，例如trpb，它允许细胞利用吲哚代替色氨酸，或hisd，它允许细胞利用组氨酸代替组氨酸(hartman，s.c.和r.c.mulligan 1988 proc natl acad sci 85:8047-51)。最近，使用可见标记物已经获得了普及，例如花青素、b-葡糖苷酸酶及其底物、gus和荧光素酶及其底物、荧光素等标记物被广泛用于不仅鉴定转化体，而且定量归因于特定载体系统的瞬时或稳定蛋白表达量(rhodes，c.a.，et al.，1995methods mol biol 55:121-131)。
56.2、impdh
ꢀⅱ
蛋白制备
57.本发明野生型impdh2可通过重组方法或化学合成方法产生。
58.如果希望高产率，优选重组方法。一般而言，重组修饰impdh多肽的生产将涉及使用宿主/载体系统，该系统通常包括以下步骤。
59.首先，获得编码野生型impdh2的核酸分子，所述impdh2序列，如seq id no:2中公开的多核苷酸序列。
60.然后，如上所述，优选将编码impdh2的核酸分子插入与合适的表达控制序列可操作连接的表达载体中，以产生包含经impdh2的序列的重组表达载体。
61.然后通过标准转化方法将表达载体导入合适的宿主中，并在允许体内产生野生型impdh2蛋白的条件下培养所得转化的宿主。例如，如果impdh2基因的表达受诱导型启动子的控制，那么合适的生长条件将包括合适的诱导剂。重组载体可以将impdh2序列整合到宿主基因组中。或者，重组载体可以在染色体外保持impdh2序列，作为自主复制载体的一部分。如此产生的impdh2蛋白从生长培养基中分离或直接从细胞中分离；
62.本领域熟练的技术人员可以容易地使本领域已知的合适的宿主/表达系统适应与野生型impdh2编码序列一起使用以产生野生型impdh2(cohen et al.,1972proc.acad.sci.usa 69:2110；and maniatis et al.,1989molecular cloning,a laboratory manual,cold spring harbor laboratory,cold spring harbor,ny))。
63.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
64.实施例1.人野生型impdh ii重组表达载体构建
65.1.1实验材料
[0066][0067]
1.2基因设计合成
[0068]
在impdh ii基因的子上游设计8
×
his标签和tev蛋白酶切割位点的基因序列，在起始密码子序列处设计nco i酶切位点，在终止密码子位点设计xho i酶切位点，合成的基因连接在了puc57质粒载体上，基因序列如seq id no.1所示：合成重组基因，其表达产物包括三个部分(如图1所示)：8 x his标签，tev酶剪切位点和impdh ii。将合成重组基因seq1插入到质粒pet28a(+)的nco i和xho i限制性内切酶之间。
[0069]
1.3酶切连接转化
[0070]
a.收到合成的含有impdh ii基因的质粒载体，使用限制性内切酶nco i和xho i酶切，获得含有野生型impdh ii基因序列，使用同样的限制性内切酶切割pet28a+空载，使用胶回收试剂盒回收基因片段和双酶切线性化的线性质粒。
[0071]
b.使用t4连接酶将目的基因片段连接到pet28a+质粒载体上。
[0072]
c.将连接产物通过42℃热激的方法转化到e.coil top10感受态细胞中，涂布在含有卡那抗生素的固体lb平板上，37℃过夜培养
[0073]
d.挑取单克隆于含有卡那抗生素的3ml液体lb培养基中，37℃，220rpm过夜培养,使用质粒抽提试剂盒抽取质粒，将质粒送测序公司测序。
[0074]
e.将测序正确的pet28a(+)-impdh ii质粒通过42℃热激的方法转化到arcticexpress(de3)prare2 bl21感受态细胞中,涂布在含有卡那抗生素的固体lb平板上，37℃过夜培养。
[0075]
f.挑取单克隆于含有卡那抗生素的3ml液体lb培养基中，37℃，220rpm过夜培养后保存菌种。
[0076]
实施例2.表达、纯化条件优化
[0077]
2.1实验材料
[0078][0079][0080]
2.2实验部分
[0081]
2.2.1表达
[0082]
a.在下午16:00左右，从-20℃取出菌种，然后在lb
g+c+k+
平板上划线，37c过夜培养。抗生素浓度如下：
[0083]
表一：所需抗生素浓度信息
[0084]
抗生素名称储液浓度(mg/ml)工作浓度(ug/ml)gentamycin4040chloramphenicol3434kanamycin5050
[0085]
b.第二天上午10点左右，从lb
g+c+k+
平板上挑取3个单克隆，分别接种到3个2ml的tb自诱导培养基中，37℃，220rpm，培养8个小时，在超净台中取出10ul留样，记为s0-1，s0-2，s0-3.然后按照1:1的比例加入4
×
sds-page loading buffer，煮沸3min，4℃保存
[0086]
c.将剩下的培养液放回37℃培养箱中继续培养
[0087]
d.第三天10点钟，分别取出过夜培养的培养液10ul，记为s1-1，s1-2，s1-3，然后按照1:1的比例加入4
×
sds-page loading buffer，煮沸3min。
[0088]
e.sds-page电泳，每孔上样15ul。按照下列顺序上样，从左至右：marker,s0-1,s0-2,s0-3,s1-1,s1-2,s1-3。
[0089]
f.电泳完毕后。分析电泳结果，看哪个样品中有impdh ii表达，然后将表达量高的那管培养液加入到1l的自诱导培养基中(用5l的带扰流板的摇瓶)，培养基中抗生素的浓度如表二所示。最终od600为0.04。然后加入消泡剂，剂量为1l培养基加4ml 5％的消泡剂表二：所需抗生素浓度信息
[0090]
抗生素名称储液浓度(mg/ml)工作浓度(ug/ml)gentamycin4040chloramphenicol3434kanamycin50100
[0091]
g.将培养瓶放入摇床37℃，120rpm培养。不同的位置温度有可能不同，会影响菌体的生长速度。
[0092]
h.一般情况下培养8-10个小时后，测量od600。当od600＝3.0-4.0时，用冰水将培养瓶降到12℃，同时调节摇床温度到12℃。
[0093]
i.12℃，120rpm继续培养7天，od600会介于14-19之间。
[0094]
j.8000rpm,4℃离心10min机收菌，并称量菌体重量
[0095]
2.2.2表达鉴定
[0096]
按照5g湿菌体加入40ml buffer a的量重悬2.2.1中收获得到的菌体，然后使用匀质机破碎收获的细胞，离心。分离离心上清和离心沉淀，同时再向离心沉淀中加入等体积buffer a再次重悬，重悬后离心。然后做sds-page鉴定，结果如图2
[0097]
2.2.3蛋白纯化
[0098]
a.菌体称重
[0099]
在进行纯化之前的头一天下班前，将在-40℃冻存的细胞转移到4℃，让细菌过夜融化。取一个500ml的空烧杯，称其重量，然后将融化后的菌体转移至离心管中，在天平上量取5g左右湿菌体。
[0100]
b.菌体重悬
[0101]
按照每1g菌体加入50ml裂解液的量，5g菌体共加入250ml裂解液，将振荡器功率调到最大，用振荡器振荡使菌体重悬，确保没有块状物存在，重悬液开起来是均一的乳白色的
悬浊液。
[0102]
c.均质机菌体裂解
[0103]
a.首先打开循环冷凝系统，待温度降到4℃后，准备破菌。
[0104]
b.均质机设置为：1000pa，5℃，破碎4次。
[0105]
c.将细菌裂解液在4℃下，12000rpm离心60min。
[0106]
d.分离离心上清和离心沉淀
[0107]
d.蛋白纯化
[0108]
设置打开akta pure蛋白纯化仪，按照下列信息设置“impdh 2 ni柱纯化方法”。
[0109]
先用去离子水清洗系统，将样品泵的s1管路，pump a的a1管路，pump b的b1管路分别放入buffer a，buffer a和buffer b中，按照5ml/min的流速，用相应的buffer清洗样品泵，pump a和pump b，每个泵清洗至少20ml体积。将his trap hp预装柱连接到柱位-2上，注意不要引入气泡。然后用pump a,管路a1，以2ml/min的流速平衡该hitrap hp柱子，体积为20ml。
[0110]
a.溶液管路设置：
[0111]
s1：待纯化样品
[0112]
s2：buffer a
[0113]
buff:去离子水
[0114]
a1：buffer a
[0115]
a2：去离子水
[0116]
b1：buffer b
[0117]
b2：20％的乙醇
[0118]
b.柱位:pos2
[0119]
c.系统流速2ml/min,上样流速2ml/min,45ml/管收集流穿液。
[0120]
d.上样时流穿的收集，45ml/管，60mm清洗时，15ml/管，150mm清洗时，15ml/管，300mm清洗时，2ml/管，500mm清洗时，2ml/管，设置如下程序：
[0121][0122]
e.sds-page检测收集到的各组分；
[0123]
f.将含有目的蛋白且无杂蛋白的超滤浓缩，然后将浓缩得到的蛋白质在4℃层析
柜透析3次，每次4h；
[0124]
g.sds-page鉴定蛋白纯化结果，结果如图3；
[0125]
裂解液(buffer a)：50mm kh2po4,300mm kcl,20mm imidazole,0.8m urea,ph8.0；
[0126]
洗脱液(buffer b)：50mm kh2po4,300mm kcl,500mm imidazole,0.8m urea,ph8.0；
[0127]
透析液：50mm kh2po4,300mm kcl,1mm dtt,0.8m urea,1mm edta,1mm pmsf,ph8.0。
[0128]
实施例3.impdh ii活性检测
[0129]
当纯化好impdh ii蛋白时，利用od280的吸收值计算所纯化蛋白的浓度(消光系数(εmg/ml＝0.466),取单位质量的蛋白(3.2ug蛋白)在日立生物化仪在单位反应时间内(3.8min)实时测定δod340。
[0130]
impdh ii催化肌酐单磷酸氧化为xmp，同时将nad还原为nadh。因此，可以通过检测nadh在340nm的光吸收来计算impdh ii的催化活性。在日立7180生化仪上测定单位时间和单位质量impdh ii催化imp形成nadh的量即可计算出impdh ii催化活力。
[0131][0132]
比活性(pmol/min/ug)＝δod
340
*vol*10
12
/(6220*m*t)
[0133]
其中，6220是nadh的摩尔消光系数，vol是反应体积，单位为l,在生化仪上的体积为200ul，即0.2x 10-3
l；m为所加impdh ii的质量，单位为ug，通常为3.2ug；t为反应时间，单位为分钟，通常为3.8分钟。由于日立7180生化仪测定的δod340是乘以了10000的数值，因此上述公式可变换为：
[0134]
specific activity(pmol/min/ug)＝(δod
340 x 0.2x10-3
x10
12
)/(6220x3.2x3.8)
[0135]
＝2640xδod
340
[0136]
纯化到的impdh ii的活力如下：
[0137]
序号蛋白名称纯化日期活力测定日期纯化体积(ml)纯化浓度(mg/ml)纯度(sds-page)比活性1impdhii-wt2020092320200924511.2395％1.672impdh ii-wt20210813202108140.77.1995.95％1.9993impdh ii-wt20211127202111284.723.5195.00％1.9694impdh ii-wt202201192022012010.72.996.91％1.932
[0138]
实施例4.impdh ii稳定性检测
[0139]
将纯化好的impdh ii保存在4℃冰箱，每隔1、3、5、7、14天分别取样按照实施例3的方法检测其活力，数据如下：
[0140][0141]
结论：纯化得到的impdh ii在4℃环境中保持活力几乎不降。
[0142]
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。