一种HPV核酸检测试剂盒及其制备方法与应用与流程

本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种hpv核酸检测试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术：

1、人乳头瘤病毒(human papillomavirus，hpv)是一种诱发外生殖器良性病变和女性子宫颈癌的主要病原体。依据不同型别与宫颈癌发生危险性的高低可将其分为低危型和中高危型hpv。高危型人乳头瘤病毒的持续感染或反复感染是造成宫颈癌及宫颈上皮内高级别病变(cin2/3)的主要原因。

2、根据cfda对人乳头瘤病毒(hpv)的划分，18种中高危型人乳头瘤病毒(hpv)包括：16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82；低危型人乳头瘤病毒(hpv)包括6、11、40、42、43、81、83等。hpv病原体检测技术有多种，主要方法有醋酸染色筛查法、碘试验筛查法、巴氏涂片检查、液基细胞学、阴道镜检查、组织学检测、分子检测等。然而，临床特征和常规的实验室检测需要专业的医生进行判读，且花费时间较长。

3、cn111020061b专利中公开了一种使用高通量测序检测人乳头瘤病毒的试剂盒和方法，其可以同时检测多达40种hpv。通过对检测结果的reads数进行判读，能避免由于高丰度对低丰度抑制而造成的低丰度型别漏检，但需要花费大量的人力物力操作，且操作者需要丰富的实验基础，整个实验流程耗时长，对于结果也需要专业的生物信息学分析等局限性。

4、cn103184294a专利中公开了一种使用pcr法同时检测hpv16和hpv18型别的多重检测方法和试剂盒。其针对hpv16，18的dna序列分别设计了2对特异性引物和2条taqman引物探针，利用不同的荧光基团组合进行标记探针，从而在同一扩增管中准确的检测并区分出hpv16，18感染。然而其具有极大地受限于实时荧光pcr仪检测荧光通道数量的限制，而导致通量低的局限性，难以满足种类繁多的hpv检测需求。

5、cn101487042a专利中公开了一种采用固相载体基片，配合hpv各亚型的寡核苷酸探针，制备成dna微阵列芯片，对hpv进行多重检测的方法和试剂盒。其通过设计特异型别的引物探针与芯片结合组成阵列，可以实现高通量检测hpv型别的效果。但其方法受限于芯片的使用导致的高成本、高工艺要求等局限性。

6、国内外大量文献和专利均已报道，采用分子检测技术，特别是pcr检测技术，具有检测快速、操作简捷、特异性好等显著优点。实时荧光定量pcr方法是一种分子生物学中常用的核酸检测方法，与普通pcr方法相比，其操作简便，应用广泛。对待测样本的靶基因进行pcr扩增过程中，通过仪器实时监测反应体系产生的荧光信号，对pcr进程进行实时检测。普通pcr扩增技术需要在完成扩增之后，对产物进行电泳分析，分析过程繁琐费时，同时pcr产物的开盖可能导致实验室环境的污染。

7、实现荧光信号的方法主要分为探针法和染料法两类，探针法通过在反应体系中添加荧光基团标记的寡核苷酸探针，通过探针的信号释放，实现对靶序列的特异性检测；染料法则是添加双链dna荧光染料在反应体系中，通过荧光染料结合到dna双链小沟中，实现对靶序列的检测；

8、在实时检测模式中，靶序列的检测和pcr扩增同时进行，无需额外的步骤。因此，实时检测模式简便直接。但是，这种模式在单管检测中能检测的最大靶序列的数目受限于实时pcr仪器的荧光检测通道的数目，一般不超过6个。因此，基于简便直接的方法学优势，需要对实时荧光定量pcr法进行改进，以期实现单管检测中检测更多的靶基因数目。

9、综述所述，虽然已经报道了多种人乳头瘤病毒检测方法，但是都有各自的局限性。因此，仍然需要开发一种更为快速简便、灵敏特异、成本低的高通量人乳头瘤病毒核酸检测方法。

技术实现思路

1、基于此，本发明的目的之一在于提供一种用于多重核酸检测的双探针组合。

2、包括如下技术方案：

3、一种用于多重核酸检测的双探针组合，其包括针对靶基因序列的u探针和b探针，所述u探针从5’端到3’端的组成依次为：5’端区、茎环区、3’端区；所述b探针从5’端到3’端的组成依次为：5’端区、3’端区；所述u探针5’端区序列为特异性靶基因序列互补的序列，3’端区序列为自然界中唯一序列，茎环区序列长度为5bp-45bp，茎环区序列5’末端修饰荧光淬灭基团，茎环区序列3’末端修饰荧光报告基团；所述b探针3’端区序列为靶基因序列互补的序列，5’端区序列为与u探针3’端区序列反向互补的自然界中唯一序列；所述u探针和b探针同时与目的片段结合时，所述u探针5’端区序列的3’端与b探针5’端区序列的5’端之间的距离为5bp～15bp；所述自然界中唯一序列为不与靶基因序列杂交的序列。

4、本发明的另一目的还在于提供上述双探针组合在制备试剂盒或试剂盒检测试剂中的应用。

5、本发明的另一目的还在于提供一种多重核酸检测试剂盒，其包括针对目标核酸序列的扩增引物组和上述双探针组合。

6、本发明的另一目的还在于提供上述多重核酸检测试剂盒在人乳头瘤病毒检测中的应用。

7、本发明的另一目的还在于提供一种人乳头瘤病毒检测方法。

8、包括如下技术方案：

9、获取待测生物样本核酸；

10、采用上述多重核酸检测试剂盒对上述生物样本核酸进行pcr检测。

11、本发明的发明人基于对人乳头瘤病毒(human papillomavirus，hpv)的遗传信息进行了深入研究，设计了一种针对hpv基因序列的u探针和b探针的双检测探针组合，通过对u探针和b探针结构的精密设计，使得在针对特定hpv型别检测时，u探针的3’端和b探针的5’端反向互补，同时u探针的5’端需与模板匹配、b探针的3’端需与模板匹配方可进行成功检测，从而足以保证检测特异性。并结合特异针对u探针和b探针相关位置距离的优化筛选发现，当u探针和b探针同时与目的片段结合，u探针5’端区序列的3’端与b探针5’端区序列的5’端之间的距离为5bp～10bp时，探针检测的性能最佳，同时当u探针上淬灭基团与荧光基团的相对位置为10bp～45bp时还能有效避免因淬灭基团与荧光基团相对位置太远而导致的淬灭效果较差，即本底荧光变强，导致真实检测效果变差。通过上述检测体系有效克服传统实时荧光定量pcr分型局限性，通过特殊信号和熔解曲线分析实现单管多重分型，并且通过各自与模板的匹配以及u探针与b探针之间的互补，极大地提高了检测特异性。

12、并基于此，开发了一种多重核酸检测试剂盒和单管检测多靶标的pcr熔解曲线方法，通过引入l型引物和通用引物体系：保证扩增的均一性；消除了由于特异性引物之间扩增效率的差异，导致的扩增产物中不同扩增子的差异。此方法操作时间短，3小时内即可完成检测，检测过程中不需要开盖，可减少pcr产物污染，且检测特异性高，可以减少pcr反应中非特异性扩增，提高方法学检测灵敏度，结果易判读。

技术特征：

1.一种用于多重核酸检测的双探针组合，其特征在于，包括针对靶基因序列的u探针和b探针，所述u探针从5’端到3’端的组成依次为：5’端区、茎环区、3’端区；所述b探针从5’端到3’端的组成依次为：5’端区、3’端区；

2.根据权利要求1所述双探针组合，其特征在于，所述u探针和b探针同时与目的片段结合时，所述u探针5’端区序列的3’端与b探针5’端区序列的5’端之间的距离为5bp～10bp。

3.根据权利要求1-2任一项所述双探针组合，其特征在于，所述u探针的茎环区序列5’末端与3’末端之间的距离为10bp～45bp。

4.权利要求1-3任一项所述双探针组合在制备试剂盒或试剂盒检测试剂中的应用。

5.一种多重核酸检测试剂盒，其特征在于，包括针对目标核酸序列的扩增引物组和权利要求1-3任一项所述双探针组合。

6.根据权利要求5所述检测试剂盒，其特征在于，所述扩增引物组包括l引物对，所述l引物对中的每一条l引物从5’端到3’端的组成依次为：5’端区、3’端区；

7.根据权利要求5-6任一项所述多重核酸检测试剂盒，其特征在于，所述扩增引物组还包括通用引物对，进一步地，所述通用引物对中的每一条通用引物与l引物对中的每一条l引物的5’端区序列为相同序列。

8.根据权利要求5-6任一项所述多重核酸检测试剂盒，其特征在于，包括以下任意至少一组组分：

9.根据权利要求5-6任一项所述多重核酸检测试剂盒，其特征在于，还包括通用引物对，进一步地，所述通用引物对序列如seq id no.47～seq id no.48所示。

10.权利要求5-9任一项所述多重核酸检测试剂盒在人乳头瘤病毒检测中的应用。

11.一种人乳头瘤病毒检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

技术总结
本发明涉及一种HPV核酸检测试剂盒及其制备方法与应用，通过发明人设计的一种针对HPV基因序列设计的U探针和B探针的双探针检测组合，并基于此，开发了一种多重核酸检测试剂盒和单管检测多靶标的PCR熔解曲线方法，通过引入L型引物和通用引物体系：保证扩增的均一性；消除了由于特异性引物之间扩增效率的差异，导致的扩增产物中不同扩增子的差异。此方法操作时间短，3小时内即可完成检测，检测过程中不需要开盖，可减少PCR产物污染，且检测特异性高，可以减少PCR反应中非特异性扩增，提高方法学检测灵敏度，结果易判读。

技术研发人员：陈嘉昌,张源明,王辉芳,刘向东,李楚明,唐海辉,王维世,胡朝晖,柳俊
受保护的技术使用者：广州市金圻睿生物科技有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15