玉米ZmWAK02基因在提高玉米灰斑病抗性中的应用

玉米zmwak02基因在提高玉米灰斑病抗性中的应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学育种技术领域，具体涉及玉米zmwak02基因在提高玉米灰斑病抗性中的应用。


背景技术：

2.玉米(zea mays l.)是世界重要粮食作物之一，全球总产量超过10亿吨，其不仅可以作为口粮，也是动物饲料和生物能源的主要原料，并在工业生产上具有非常广泛的用途。
3.灰斑病是玉米最常见的病害之一，大面积爆发可造成减产超过50％；近年来，灰斑病在玉米产区持续流行，已经成为严重威胁玉米产量和品质的主要病害，并有向更大范围扩散的趋势。灰斑病的防治主要依赖于抗病品种的选育，筛选可用的抗病种质资源并利用分子标记辅助选择育种(molecular marker-assisted selection,mas)是实现快速培育抗灰斑病玉米新品种的有效途径。前人研究通过田间表型考察筛选得到了一部分抗灰斑病的玉米种质资源，并进一步运用多种遗传分析手段鉴定到了大量与玉米抗灰斑病相关的数量性状位点(quantitative trait loci,qtl)，然而在实际育种过程中，其中很多抗病qtl由于效应小和区间过大等原因难以被利用。目前已有的研究成果还远远无法满足当前针对玉米抗灰斑病分子育种的需求。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供玉米zmwak02基因在提高玉米灰斑病抗性中的应用，zmwak02基因为玉米主效抗灰斑病基因，zmwak02基因能够有效提高玉米灰斑病抗性。
5.本发明提供了与灰斑病抗病性相关的蛋白质，包括a1)～a3)所述蛋白质中的一种或几种：
6.a1)氨基酸序列如seq id no.1所示的蛋白质；
7.a2)将a1)所述的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物灰斑病抗病性相关的蛋白质；
8.a3)来源于玉米且与a1)所述的蛋白质具有95％以上同一性且与植物灰斑病抗病性相关的蛋白质。
9.本发明还提供了编码上述方案所述蛋白质的核酸分子。
10.优选的，所述核酸分子包括b1)～b3)所述核酸分子中的一种或几种：
11.bl)zmwak02基因，核苷酸序列如seq id no.2所示；
12.b2)来源于玉米且与bl)具有95％以上同一性的核酸分子；
13.b3)与bl)或b2)限定的核苷酸序列杂交的核酸分子。
14.本发明还提供了含有上述方案所述核酸分子的dna分子、表达盒、重组载体或重组微生物。
15.本发明还提供了上述方案所述蛋白质或者所述的核酸分子或者所述的dna分子、表达盒、重组载体或重组微生物的在调控植物的灰斑病抗病性中的应用；优选的，所述植物
包括玉米。
16.优选的，所述调控植物的灰斑病抗病性包括提高植物的灰斑病抗病性。
17.本发明还提供了一种用于检测玉米灰斑病抗病性的引物组，包括核苷酸序列如seq id no.8所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.9所示的下游引物。
18.本发明还提供了一种植物转基因育种的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入上述方案所述的核酸分子或者所述的dna分子、表达盒、重组载体或重组微生物，得到灰斑病抗病性增强的转基因植物。
19.优选的，所述出发植物优选的包括玉米。
20.本发明还提供了一种植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中上述方案所述蛋白质的含量和/或活性；所述目的植物优选的包括玉米。
21.本发明提供了与灰斑病抗病性相关的蛋白质。本发明的蛋白质是一种细胞壁相关激酶(wall-associated kinase)，其可通过基因zmwak02编码得到。基因zmwak02是利用遗传学的方法在玉米第1号染色体上分离的主效抗灰斑病基因。转基因材料表型分析显示：导入zmwak02基因能够提高感病玉米自交系超过30％的灰斑病抗病性。zmwak02的遗传转化研究可为玉米抗灰斑病育种提供基因资源和理论支撑。
附图说明
22.图1为pmb2362表达载体的物理图谱；
23.图2为转基因互补试验表型；其中，a为转基因玉米的抗灰斑病表型比较(整株)；左边为转基因阳性材料，包含zmwak02基因并表现为抗灰斑病表型；右边为转基因阴性材料，不包含zmwak02基因并表现为感灰斑病表型；b为转基因玉米的抗灰斑病表型比较结果(单个叶片)；上方为转基因阳性材料，包含zmwak02基因并表现为抗灰斑病表型；下方为转基因阴性材料，不包含zmwak02基因并表现为感灰斑病表型；c为转基因植株灰斑病病情评分，对来自两个独立家系(l1和l2)的阳性和阴性植株评分，数据以平均值
±
标准差表示，每一列顶部的数字表示用于比较的样本量，学生t检验(双尾检验)表明，阳性和阴性植株的灰斑病抗性存在显著差异，****p《0.0001，每个灰点或灰色方块代表单个植株的病情严重程度；
24.图3为实施例1中扩增片段1电泳图；
25.图4为实施例1中扩增片段2电泳图；
26.图5为实施例1中阳性克隆电泳结果；
27.图6为玉米灰斑病病情分级标准。
具体实施方式
28.本发明提供了与灰斑病抗病性相关的蛋白质，包括a1)～a3)所述蛋白质中的一种或几种：
29.a1)氨基酸序列如seq id no.1所示的蛋白质，具体为：
[0030][0031][0032]
a2)将a1)所述的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物灰斑病抗病性相关的蛋白质；
[0033]
a3)来源于玉米且与a1)所述的蛋白质具有95％以上同一性且与植物灰斑病抗病性相关的蛋白质。
[0034]
本发明的蛋白质是一种细胞壁相关激酶(wall-associated kinase)，，在玉米自然群体中非常稀有，其可通过基因zmwak02编码得到。
[0035]
本发明还提供了编码上述方案所述蛋白质的核酸分子。
[0036]
在本发明中，所述核酸分子包括b1)～b3)所述核酸分子中的一种或几种：
gagttgtttg tgtatttcta aatcttaaaa attaggcaat acatcacttt attatggttt tgtgaaaact acaaaatagt tatccttcca actatagttt atcgttttcg atcattttcg aataaccgac aatttcgatc ccgtatttcg accattgttt ttcgctttcg ttttcgttcc tgcaaaaaaa tatgaaaaca aaaacaattt agatgttttt tcgatcgttt tcgaccgttt tcatccctaa cgggagcgcc ctaccgagcg tgttttaaat tgatactaat ttgattggta agtggctaga tataagaaat aaagagaggg aataattcat aattagctac tatagagtaa acacataaaa agttggtcat atatgtacct tatacaaaaa ggaaaatgaa tgtaattcca agaaaaagat ttaaaacgat catgtgaaaa agggagcaaa tgtaaaagta atattgaaat gcgtacctat tttgcaatgt ggctgcctta gggtgatcag tagagcaata agatgttcat gtcacacaga gtgatgggaa aacttttaga tttccatcgc ttgcatttaa aaaaacacta atgcaagtga cagttcatta ggaaagggaa aataaaatag tataaacgtt catattttat ataaatctat ctctctttaa aacgtcgctt cagtactgga aatgtccttc aagtacaaca caaatagatt tgaaaaagtt agtggtaatt aactactatg taacatgtac acgtacaaca tgaatcagac ttactgtacc ataggaaaag aaatataata gtaagacatg aatacttggc taggaaagca taaggttctc caaacgttct tttggtcacc tttgtacttc agaaactacc cattccaaaa atatggagca tatgctcaac ctttaaatag tctcctctta tgttcttggc aaaccgtacg tcatcatcta aatatcacta ccggaaacga gtgctttgcc gagtgcccga agcactcggc aaagccttaa aaacactcgg caaaggcttt gccgagtgtc acactcggca aagaaggctc agcaaacagt gcatcggcaa agccttcttt gccgagtact ttttctcgga gcactcggca aagaaaagca gccgttacgg cgacgggtga cggagacggc gtctttgccg agtgtcacgg atgacactcg gcaaa；
[0039]
b2)来源于玉米且与bl)具有95％以上同一性的核酸分子；
[0040]
b3)与bl)或b2)限定的核苷酸序列杂交的核酸分子。
[0041]
在本发明中，seq id no.2所示的核苷酸序列包含了启动子和终止子。
[0042]
在本发明中，基因zmwak02是利用遗传学的方法在玉米第1号染色体上分离的主效抗灰斑病基因。转基因材料表型分析显示：导入zmwak02基因能够提高感病玉米自交系超过30％的灰斑病抗病性。zmwak02的遗传转化研究可为玉米抗灰斑病育种提供基因资源和理论支撑。
[0043]
本发明还提供了含有上述方案所述核酸分子的dna分子、表达盒、重组载体或重组微生物。
[0044]
在本发明中，所述重组载体的原始载体优选的包括转基因载体pzz01523，插入位点为图1所示载体图谱上的2865～12200bp。
[0045]
本发明对构建所述dna分子、表达盒、重组载体或重组微生物的方法没有特殊限制，采用本领域的常规方法即可。
[0046]
本发明还提供了上述方案所述蛋白质或者所述的核酸分子或者所述的dna分子、表达盒、重组载体或重组微生物的在调控植物的灰斑病抗病性中的应用。
[0047]
在本发明中，所述调控植物的灰斑病抗病性包括提高植物的灰斑病抗病性。
[0048]
在本发明中，所述植物优选的包括玉米，更优选的包括高感灰斑病的玉米；在本发明具体实施过程中，所述高感灰斑病的玉米为玉米自交系kn5585。本发明运用转基因技术，在高感灰斑病的高感灰斑病的玉米中表达zmwak02抗病基因能够提高玉米灰斑病的抗性。
[0049]
本发明还提供了一种用于检测玉米灰斑病抗病性的引物组，包括核苷酸序列如seq id no.8所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.9所示的下游引物。
[0050]
本发明还提供了一种植物转基因育种的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入上述方案所述的核酸分子或者所述的dna分子、表达盒、重组载体或重组微生物，得到灰斑病抗病性增强的转基因植物。
[0051]
在本发明中，所述出发植物优选的包括玉米，更优选的包括高感灰斑病的玉米；在本发明具体实施过程中，所述高感灰斑病的玉米为玉米自交系kn5585。
[0052]
本发明还提供了一种植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中上述方案所述蛋白质的含量和/或活性；所述目的植物优选的包括玉米，更优选的包括高感灰斑病的玉米；在本发明具体实施过程中，所述高感灰斑病的玉米为玉米自交系kn5585。
[0053]
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
[0054]
实施例1：
[0055]
zmwak02克隆
[0056]
构建zmwak基因组互补载体：以sb12基因组dna为模板克隆了zmwak基因的基因组序列(包含其自身约3kb启动子和约2kb终止子)，并将它构建到转基因载体pzz01523中(图1)；由于克隆的基因序列过长，利用高保真dna聚合酶难以直接扩增全长，因此我们将全长基因分为两段分别进行扩增，最终利用多片段一步法连接试剂盒(multis one step cloning kit)将两个片段同时克隆到转基因载体pzz01523中。
[0057]
具体如下所示：
[0058]
1.载体pzz01523酶切：
[0059][0060]
smaⅰ酶切位点：
[0061]
ccc|ggg(seq id no.3)
[0062]
反应条件:30℃、14h～16h；
[0063]
酶切后的载体纯化回收。
[0064]
2.目的片段扩增：使用高保真dna聚合酶(max super-fidelity dna polymerase)
[0065]
植株(sb12；抗病亲本)叶片总dna的提取采用ctab法，pcr扩增程序为：95℃预变性3min，然后以95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸3min，进行34个循环，最后72℃延伸5min。
[0066]
pcr扩增体系为：
[0067][0068][0069]
扩增片段1：4178bp，电泳图参见图3。
[0070]
引物序列
[0071]
f:agcttatggcgcgccttccctttgccgagtgtcatccgt(seq id no.4)；
[0072]
r:caatcccaaaaggaaatggaacg(seq id no.5)；
[0073]
扩增片段2：5180bp，电泳图参见图4。
[0074]
引物序列
[0075]
f:tttaaacgcactagtatcccatggtgctcaaggatgtggg(seq id no.6)；
[0076]
r:cgttccatttccttttgggattg(seq id no.7)。
[0077]
3.连接；使用多片段一步法连接试剂盒(multis one step cloning kit)
[0078]
连接体系：
[0079]
[0080]
连接程序：37℃30min。
[0081]
4阳性克隆检测:使用高保真dna聚合酶(vazyme 2
×
max master mix)
[0082]
特异性引物
[0083]
f:gagagggcaaacacgccagc(seq id no.8)；
[0084]
r:cagttcctaatactcggtgc(seq id no.9)。
[0085]
pcr扩增程序为：94℃预变性5min，然后以94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，进行34个循环，最后72℃延伸5min。pcr扩增体系为：
[0086]
成分体积(μl)2
×
buffer7.5forwardprimer(10μm)0.5reverseprimer(10μm)0.5dna(50ng/μl)1ddh2o5.5total15
[0087]
扩增片段大小528bp。电泳结果参见图5，由图5可以看出，获得阳性克隆；并进一步通过sanger测序确认目的基因的序列完全正确。
[0088]
实施例2：zmwak02在玉米中的遗传转化
[0089]
将构建好的转基因载体送至江苏未米生物科技有限公司进行转化，转基因受体玉米自交系kn5585易感灰斑病；2020年，在湖北鄂州基地播种从江苏未米生物科技有限公司获得的t1代转基因玉米种子，进行基因型鉴定并全部自交授粉；2021年，在海南三亚基地对t2代的不同转基因事件中分离产生的阴性和阳性材料分别自交，获得t3代的转基因家系；2021年，对t3代转基因家系进行抗灰斑病表型的鉴定分析，自然条件下发病，不需要人工接种致病菌。抗病表型鉴定依据1～9的等级评分标准，参见表1和图6，1为高抗表型，9为高感表型。
[0090]
表1玉米灰斑病病情分级标准
[0091][0092]
结果显示：导入zmwak02能够显著提升玉米的抗灰斑病能力；在两个独立的转基因互补事件中，导入zmwak02分别提高了36.5％和48％的抗病性，说明zmwak02基因具有很高的效应。因此本发明为玉米抗灰斑病改良提供了新的基因资源。
[0093]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。