一种红托竹荪ISSR分子标记引物组、反应体系及其在种群遗传多样性中的应用的制作方法

本发明属于分子生物学，尤其涉及一种红托竹荪issr分子标记引物组、反应体系及其在种群遗传多样性中的应用。

背景技术：

1、红托竹荪(dictyophora rubrovolvata)隶属鬼笔科(phallaceae)、鬼笔属(phallus)真菌，为贵州最具特色的食用菌之一，是全省重要栽培品种。野生资源主要分布于贵州、云南等竹林下的腐殖土，主产于贵州。红托竹荪风味独特、营养丰富、价值高，富含多种多糖，具有较强的还原能力和抑制羟基自由基能力，同时具有的明显的体外抗氧化活性。

2、分子标记技术是区别于形态标记、细胞标记和生化标记的一种育种相关的遗传标记，具有共显性且对隐性性状选择比较便利，能够直接反映生物个体或种群间基因组中某种差异。分子标记的检测手段在食用菌种质资源系统鉴定和育种研究中得到比较广泛的应用，issr(inter-simple sequence repeat，简单重复序列间扩增)分子标记技术具有操作简单、快速、高效的特点，广泛应用于食用菌种质资源鉴定、亲缘关系分析、遗传多样性等方面。但是目前在红托竹荪中，应用issr分子标记分析种质资源鉴定、遗传多样性分析的方法尚未见报道。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种红托竹荪issr分子标记引物组和反应体系，为红托竹荪资源鉴定、遗传多样性分析等科学研究提供很好的技术指导和理论支持。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供了一种红托竹荪issr分子标记引物组，所述引物组的核苷酸序列如seq id no.1-seq id no.34所示。

4、本发明还提供了一种红托竹荪issr-pcr反应体系，每25ul的反应体系中含有模板dna 1ul，上述任意一条引物1ul，2×taq pcr starmix with loading dye 12.5ul，ddh2o10.5ul。

5、优选的，pcr扩增程序为：94℃，2min；94℃，30s，40-60℃退火1min，72℃，45s，35个循环；72℃，10min，4℃保存。

6、优选的，所述退火的温度根据所选择的引物来确定，具体如下：

7、

8、本发明还提供了一种上述引物组或上述反应体系在红托竹荪种群遗传多样性评价或分子标记辅助育种中的应用。

9、本发明还提供了一种评价红托竹荪种群遗传多样性的方法，包括如下步骤：

10、提取红托竹荪全基因组dna，采用上述反应体系对提取获得的dna进行扩增，电泳分离，检测条带，利用上述分子标记引物组将不同来源的红托竹荪进行遗传聚类分析，计算红托竹荪材料遗传多样性参数。

11、优选的，所述电泳分离为在2％琼脂糖凝胶上进行电泳分离。

12、优选的，所述聚类分析具体为：读取电泳分离后检测的条带信息，将电泳图谱上100-2000bp范围内清晰且重复出现的条带记为1，同一位置没有条带记为0，由此生成0和1原始矩阵；统计每条引物扩增出的总条带数和多态性条带数；用聚类分析软件ntsys-pc中upgma法进行聚类分析，用tree plot模块生成聚类图，构建分子进化树。

13、优选的，所述计算红托竹荪材料遗传多样性参数具体为：根据0、1二元数据矩阵，统计issr扩增产物的条带总数和多态性条带数，计算多态性条带所占的比率；釆用popgene32软件对所有试验材料进行遗传多样性参数计算：等位基因数、有效等位基因数、shannon's信息指数和基因多样性指数。

14、本发明的有益效果：

15、本发明优化了红托竹荪基因组dna的issr反应条件，利用优化的pcr反应体系，筛选出的34条issr引物在红托竹荪中pcr扩增反应稳定，扩增片段清晰，多态性高。采用本发明引物组和反应体系能够加快红托竹荪资源的鉴定速度，缩短实验时间，结果稳定可靠，弥补了传统形态学鉴定方法的不足。本发明成本低，在短时间内能够完成大批实验材料鉴定。利用本发明提供的方法能很好的揭示红托竹荪居群间的遗传多样性，分辨红托竹荪种质资源间的亲缘关系，对红托竹荪资源的保护及利用具有重要意义。

技术特征：

1.一种红托竹荪issr分子标记引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列如seqid no.1-seq id no.34所示。

2.一种红托竹荪issr-pcr反应体系，其特征在于，每25ul的反应体系中含有模板dna1ul，权利要求1所述任意一条引物1ul，2×taq pcr starmix with loading dye 12.5ul，ddh2o 10.5ul。

3.根据权利要求2所述的反应体系，其特征在于，pcr扩增程序为：94℃，2min；94℃，30s，40-60℃退火1min，72℃，45s，35个循环；72℃，10min，4℃保存。

4.根据权利要求3所述的反应体系，其特征在于，所述退火的温度根据所选择的引物来确定，具体如下：

5.权利要求1所述引物组或权利要求2-4任意一项所述反应体系在红托竹荪种群遗传多样性评价或分子标记辅助育种中的应用。

6.一种评价红托竹荪种群遗传多样性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述电泳分离为在2％琼脂糖凝胶上进行电泳分离。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述聚类分析具体为：读取电泳分离后检测的条带信息，将电泳图谱上100-2000bp范围内清晰且重复出现的条带记为1，同一位置没有条带记为0，由此生成0和1原始矩阵；统计每条引物扩增出的总条带数和多态性条带数；用聚类分析软件ntsys-pc软件中upgma法进行聚类分析，用tree plot模块生成聚类图，构建分子进化树。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述计算红托竹荪材料遗传多样性参数具体为：根据0、1二元数据矩阵，统计issr扩增产物的条带总数和多态性条带数，计算多态性条带所占的比率；釆用popgene32软件对所有试验材料进行遗传多样性参数计算：等位基因数、有效等位基因数、shannon's信息指数和基因多样性指数。

技术总结
本发明提供了一种红托竹荪ISSR分子标记引物组、反应体系及其在种群遗传多样性中的应用，属于分子生物学技术领域。本发明提供的红托竹荪ISSR分子标记引物组的核苷酸序列如SEQIDNO.1‑SEQIDNO.34所示，用于红托竹荪遗传多样性分析的ISSR‑PCR反应体系，每25ul中含有模板DNA1ul，上述引物1ul，2×TaqPCRStarMixwithLoadingDye12.5ul，ddH<subgt;2</subgt;O10.5ul。本发明ISSR分子标记引物组和反应体系在红托竹荪中PCR扩增反应稳定，扩增片段清晰，多态性高。采用本发明引物组和反应体系能够加快红托竹荪资源的鉴定速度，结果稳定可靠。

技术研发人员：卢颖颖,刘宏宇,黄万兵,朱国胜,桂阳,龚光禄,杨通静,李彪,黄晓润,尚念杰,刘倾城
受保护的技术使用者：贵州省农作物品种资源研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15