一种微生物菌剂的制作方法

1.本发明涉及一种微生物菌剂，属于农业栽培领域。


背景技术：

2.红薯（ipomoea batatas(l.)，sweet potato）有营养丰富、稳定性好、产量高等优点，兼有粮食作物、经济作物、蔬菜作物和饲草作物的特点，广泛种植于世界上100多个国家，本世纪甘薯将成为世界上第5大粮食能源供应植物。红薯是我国重要的低投入、高产出、耐干旱、耐瘠薄、多用途的粮食、饲料、工业原料作物和新型的生物能源作物，在我国仅次于水稻、小麦和玉米，居第4位。近年来，市场对红薯的需求日益高涨，种植面积不断扩大。然而，病毒病是严重威胁红薯生产的重要病害，是导致红薯产量降低和种性退化的重要因素，是红薯产业发展的重要限制因素。
3.如红薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus，spfmv)在世界红薯种植区均有发生，严重影响红薯的产量和品质，造成红薯产量损失可达 20%～30%，严重的可达50%以上。红薯褪绿矮化病毒 (sweet potato chlorotic stunt virus，spcsv)是危害红薯的主要病毒之一， 且spcsv可与spfmv协生共侵染红薯引起红薯病毒病害spvd (sweet potato virus disease，spvd)，感染spvd的红薯表现叶片扭曲、畸形、叶片褪绿、明脉以及植株矮化等症状，spvd通常能使红薯减产50%～98%。在田间，spfmv可由蚜虫以非持久性方式传播，spcsv可由粉虱以半持久性方式传播。由于红薯是无性繁殖作物，经病毒感染便会在体内逐渐积累，携带病毒随种薯、种苗进行传播，病毒通过薯块和薯苗不断累积，随着无性繁殖代数增加导致带毒情况加重，病害逐步加重，从而增加了病毒病防治的难度。当前防治红薯病毒病害，主要以栽种脱毒红薯苗、加强栽培管理和选用抗病品种为主。红薯遗传上高度杂合、种间种内杂交不亲和以及多倍性，红薯常规育种存在诸多困难；红薯病毒种类繁多，遗传变异快，导致品种抗性易丧失。因此，开发与应用新型抗性技术成为红薯病毒病防御的重要技术保障。
4.最近几年，生物法防治病害日益受到重视。益生菌可参与植物的防卫功能，增强植物抗逆境、抗病毒、抗动物危害的能力，还可为植物提供氮源、激素等营养物质。植物益生菌是生物防控制剂，它们的代谢产物可防治病毒、细菌、真菌，还可促进植物对n、p、k的吸收，并能够防止非生物伤害等。然而，采用何种益生菌解决红薯种植存在的病毒病害问题，以及采用何种益生菌能具有好的抑菌效果和释放营养素来制备红薯脱毒苗的育苗技术，以抑制或杀灭种薯中潜在或已存在的病毒等病原微生物，都没有好的技术报道，需要研究。


技术实现要素：

5.为解决现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于给出一种微生物菌剂，用于红薯减毒苗育苗，该微生物菌剂良好的抑菌效果和释放营养素的能力，并给出微生物菌剂的制备方法和应用技术。
6.本发明的技术方案是：一种微生物菌剂，具有活性成分苏云金杆菌ff05-2和肠杆
菌属05-2，苏云金杆菌ff05-2的dna基因序列表如seq id no.1所述；肠杆菌属05-2的dna基因序列表如seq id no.2所述；所述苏云金杆菌ff05-2的分类名为bacillus thuringiensis，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2021年05月17日，保藏编号为cgmcc no.22542；所述肠杆菌属05-2的分类名为enterbacter soli，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2021年05月17日，保藏编号为cgmcc no.22541。
7.所述微生物菌剂应用于红薯减毒苗培育中，用于增强红薯中营养物质释放和抑菌的能力，从而有效抑制种薯中的病毒及其他不良微生物的活动，提高红薯苗的质量。菌株活性成分苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2抑制蚜虫、粉虱和大肠杆菌，并能促进种薯发芽和提高发芽率，苏云金杆菌ff05-2具有溶解无机磷而释放磷元素，并具有纤维素酶活和固氮酶酶活，能分泌生长素；肠杆菌属05-2溶解无机磷、有机磷和不容性钾，并具有固氮酶活和分泌生长素；两株菌株间协同促进生长，高效释放营养元素以利于红薯的发芽，促进菌株在种薯内的定殖；菌株在种薯内定殖后，将利用种薯内的营养物质进行繁殖和代谢，菌株在这个过程中将产生大量的杀虫和抑菌的代谢物，降低病毒和病原菌对红薯苗的伤害。这解决或缓解了红薯发芽期间病虫害的问题。在苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2对不良微生物的抑制作用下，红薯苗茁壮成长；苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2在红薯中生长繁殖的代谢产物如有机氮、生长素等促进了红薯苗对可吸收养分的获得；甘薯苗中将富集大量的苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2，以抵抗土壤和空气环境里不良微生物侵染，有利于甘薯苗在大田土壤中的健康生长。
8.应用步骤如下：（1）种薯选择和处理：选取无病害虫斑的红薯为种薯，装入网袋内，量取微生物菌剂发酵液并用自来水稀释10倍，将装有种薯的网袋浸没入微生物菌剂的10倍稀释液中，浸泡30 min后取出网袋并把种薯排入沙中直至发芽；（2）减毒苗：红薯苗长到8-9片叶子时，切取0.3～0.5mm的茎尖组织进行组织培养，获得携带苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2的减毒苗；减毒苗的苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2的克隆数：减毒红薯苗中苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2的克隆数分别为有1
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7 cfu/g红薯苗；（3）减毒苗的病毒检测：采用rt-pcr检测红薯中褪绿矮化病毒和羽状斑驳病毒，减毒苗中没有这两类病毒的检出；（4）减毒红薯苗的田间栽播：减毒红薯苗长大后进行移栽，在大田中生长到霜降前进行红薯块根的收获，红薯块根产量增加20%
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40%。
9.所述微生物菌剂的制备方法，步骤如下：步骤一、采用ashby（阿须贝）固体培养基将苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2活化，并采用ashby（阿须贝）液体培养基进行培养，得到这两种菌株的一级培养菌；步骤二、将培养得到的苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2的一级培养菌按cfu比1:2进行混合，按照10%的接种量把混合菌液放入发酵液体培养基进行发酵培养，在37℃条件下培养10-12 h，得到发酵的微生物菌剂。
10.所述步骤一中，取出-20℃条件下保存的苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2，分别用接种环蘸取少许菌液于ashby（阿须贝）固体培养基上划线，于37℃条件下培养10～12 h；
用接种环挑取该固体培养基上的单菌落，接种于ashby（阿须贝）液体培养基的100 ml三角瓶中，于37℃条件下培养8~10 h得到活化的菌株；此时，每毫升ashby（阿须贝）液体培养基中至少含有1
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8 cfu苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2。
11.所述苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2采用ashby（阿须贝）液体培养基培养，所述微生物菌剂由苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2的液体培养物按cfu比1:2组成。
12.所述步骤二中，发酵液体培养基每升的组成及含量为：mgso4·
7h2o 0.2g/l；nacl 0.2g/l；甘露醇 10g/l；k2hpo40.2g/l；caco
3 2.0g/l；蛭石2.0g/l；ph值6.4，121℃灭菌15分钟。
13.本发明的有益效果：（1）通过两种菌株的复合增强红薯中营养物质释放和抑菌的能力，从而有效抑制种薯中的病毒及其他不良微生物的活动，提高红薯苗的质量，红薯块根增产20%～40%；（2）利用茎尖组织采用现有技术进行组织培养，相对于常规红薯育苗中通过其块根发芽的做法，可以大幅度减少红薯育苗的原料使用量；（3）两株菌株间具有协同促进生长的作用，高效的释放营养元素以利于红薯的发芽，促进菌株在种薯内的定殖；菌株定殖后利用种薯内的营养物质进行繁殖和代谢，产生大量的杀虫和抑菌的代谢物，从而减少害虫对病毒的传播，降低病毒和病原菌对红薯苗的伤害；（4）在红薯中生长繁殖的代谢产物如有机氮、生长素等促进了红薯苗对可吸收养分的获得；甘薯苗中将富集大量的苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2，以抵抗土壤和空气环境里不良微生物侵染，有利于甘薯苗在大田土壤中的健康生长。
附图说明
14.图1为减毒苗在移栽后一天内长出根的照片；图2为减毒苗在春棚生长照片；图3为粘土、雨水浸泡一个月后收获的红薯块根照片。
具体实施方式
15.下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下，所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
16.为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法；所使用的试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，所述百分含量或浓度，如无特殊说明均为质量百分数。
17.实施例1一种微生物菌剂，具有活性成分苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2，苏云金杆菌ff05-2的dna基因序列表如seq id no.1所述；肠杆菌属05-2的dna基因序列表如seq id no.2所述；所述苏云金杆菌ff05-2的分类名为bacillus thuringiensis，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2021年05月17日，地址为北京市朝
阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.22542；所述肠杆菌属05-2的分类名为enterbacter soli，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2021年05月17日，保藏编号为cgmcc no.22541。
18.微生物菌剂应用于红薯减毒苗，用于增强红薯中营养物质释放和抑菌的能力，从而有效抑制种薯中的病毒及其他不良微生物的活动，提高红薯苗的质量。菌株活性成分苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2对蚜虫、粉虱和大肠杆菌有显著的抑制效果，并能显著促进种薯发芽和提高发芽率，苏云金杆菌ff05-2还具有溶解无机磷而释放磷元素的能力，还具有纤维素酶活和固氮酶酶活，能分泌生长素；肠杆菌属05-2有溶解无机磷有机磷和溶解不容性钾的能力，还具有固氮酶活和分泌生长素的能力；两株菌株间具有协同促进生长的作用，高效的释放营养元素以利于红薯的发芽，促进菌株在种薯内的定殖；菌株在种薯内定殖后，将利用种薯内的营养物质进行繁殖和代谢，菌株在这个过程中将产生大量的杀虫和抑菌的代谢物，这些代谢物将抑制或杀灭红薯苗的病虫病菌，从而减少害虫对病毒的传播，降低病毒和病原菌对红薯苗的伤害。
19.这解决或缓解了红薯发芽期间病虫害的问题。在苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2对不良微生物的抑制作用下，红薯苗茁壮成长；苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2在红薯中生长繁殖的代谢产物如有机氮、生长素等促进了红薯苗对可吸收养分的获得；甘薯苗中将富集大量的苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2，以抵抗土壤和空气环境里不良微生物侵染，有利于甘薯苗在大田土壤中的健康生长。
20.实施例2作用一种应用例，首先进行种薯选择和处理，选取无病害虫斑的红薯为种薯，装入网袋内，量取微生物菌剂发酵液并用自来水稀释10倍，将装有种薯的网袋浸没入微生物菌剂的10倍稀释液中，浸泡30 min后取出网袋并把种薯排入沙中直至发芽。
21.红薯苗长到8-9片叶子时，切取0.3～0.5mm的茎尖组织进行组织培养，获得携带苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2的减毒苗；减毒苗的苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2的克隆数：减毒红薯苗中苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2的克隆数分别为有1
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7 cfu/g红薯苗；如图1所示，图1 减毒苗在移栽后的一天内长出根，根多于非处理组。
22.进行减毒苗的病毒检测，采用rt-pcr检测红薯中褪绿矮化病毒和羽状斑驳病毒，减毒苗中没有这两类病毒的检出。
23.将减毒红薯苗在田间栽播，减毒红薯苗长大后进行移栽，在大田中生长到霜降前进行红薯块根的收获，试验田中，红薯块根产量增加40%。
24.实施例3作为实施例1的微生物菌剂的制备方法，步骤如下：步骤一、采用ashby（阿须贝）固体培养基将苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2活化，并采用ashby（阿须贝）液体培养基进行培养，得到这两种菌株的一级培养菌；步骤二、将培养得到的苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2的一级培养菌按cfu比1:2进行混合，按照10%的接种量把混合菌液放入发酵液体培养基进行发酵培养，在37℃条件下培养10-12 h，得到发酵的微生物菌剂。
25.所述步骤一中，取出-20℃条件下保存的苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2，分别用接种环蘸取少许菌液于ashby（阿须贝）固体培养基上划线，于37℃条件下培养10～12 h；
用接种环挑取该固体培养基上的单菌落，接种于ashby（阿须贝）液体培养基的100 ml三角瓶中，于37℃条件下培养8~10 h得到活化的菌株；此时，每毫升ashby（阿须贝）液体培养基中至少含有1
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8 cfu苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2。
26.所述苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2采用ashby（阿须贝）液体培养基培养，所述微生物菌剂由苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2的液体培养物按cfu比1:2组成。
27.所述步骤二中，发酵液体培养基每升的组成及含量为：mgso4·
7h2o 0.2g/l；nacl 0.2g/l；甘露醇 10g/l；k2hpo40.2g/l；caco
3 2.0g/l；蛭石2.0g/l；ph值6.4，121℃灭菌15分钟。
28.实施例4作用一种应用例，我们进行了如下的操作过程。
29.步骤一、红薯苗的冬暖棚生长：减毒红薯苗在砂钵中生长25天左右，采用稀释10倍的苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2发酵液浸苗的方式，浸泡40 min后再移栽到冬暖棚的土壤中进行快繁，棚中温度≥12℃，如图2所示，图2为减毒苗在春棚生长照片；微生物菌剂培养的减毒红薯苗在大棚中茁壮成长；冬暖棚生长1个月左右时，菌剂处理的减毒红薯苗比菌剂不处理脱毒苗表现出如下优势：茎的直径变大，叶面积变大，叶片变厚；步骤二、红薯苗的春棚生长：冬暖棚中的微生物菌剂处理的红薯苗生长1个月左右后，剪取下来，采用稀释10倍的苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2发酵液浸苗的方式，浸泡40 min后再移栽到到春大棚的土壤中进行快繁，红薯苗在大棚中进行快速繁殖，长度在原有基础上不断生长，有2-7个分叉；步骤三、红薯苗的大田生长：剪取春棚中的微生物菌剂处理的减毒红薯苗，用稀释10倍的苏云金杆菌ff05-2和肠杆菌属05-2发酵液浸苗的方式，浸泡40 min后再移栽到大田的土壤中。整个生长期，红薯对干旱或水涝就较好的耐受性；而没有处理的甘薯在干旱或水涝时表现为生长缓慢，甚至不结薯；图3为粘土、雨水浸泡一个月后收获的红薯块根照片，通过对比种植，增产效果明显。即使在雨水适宜的条件下，微生物菌剂培育红薯减毒苗的红薯块根产量也能增加 20%以上。
30.从上述结果可看出，用本发明提供的微生物菌剂处理的红薯减毒苗，在红薯减毒苗的制备时间段和减毒红薯苗的快繁时间段，红薯苗的各项指标均达到了良好的效果。与没有菌剂处理的红薯脱毒苗相对比，红薯苗在减毒苗期间表现为减毒苗生长快和壮的特征，冬暖棚和春棚的红薯苗表现为叶面积变大、茎直径大等优良特征，红薯苗在大田种植后取得了对水的适应性强、产量提高的结果。
31.上述说明仅为本发明的优选实施例，并非是对本发明的限制，凡在本发明的内容范围内所做出的任何修改、等同替换、改型等，均应包含在本发明的专利保护范围之内。