一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的Nrf2激动肽

本发明涉及生物，具体涉及一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的nrf2激动肽。

背景技术：

1、机体处于氧化应激状态可以释放大量ros，诱使细胞内脂质发生过氧化反应、酶活性降低、蛋白质结构发生变化引起细胞和组织氧化损伤。nrf2-are信号通路是最重要的抗氧化通路之一，可以调控内源性抗氧化酶的表达。正常生理条件下，核因子红细胞2相关因子2(nrf2)与kelch样ech关联蛋白1(keap 1)在细胞质中结合并通过泛素化降解，维持nrf2含量在生理需要水平；当机体受到氧化应激时，ros可以导致keap 1的半胱氨酸残基被修饰与nrf2发生解离[，nrf2通过去泛素化被释放出来进入细胞核，在核内与抗氧化反应元件(are)结合从而上调抗氧化酶和ⅱ相解毒酶的表达来清除过多的自由基，如血红素氧合酶-1(ho-1)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸：醌氧化还原酶1(nqo1)、超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽过氧化酶(gsh-px)等。研究发现，激活nrf2-are信号通路可促进细胞保护基因转录，减少氧化应激受到的损伤，起到肾脏保护作用。

技术实现思路

1、一方面，本发明提供了一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的nrf2激动肽(psrilyg)，pro-ser-arg-ile-leu-tyr-gly，该寡肽有显著的抗氧化活性，能激活nrf2通路从而保护细胞免受氧化损伤。

2、另一方面，本发明提供了一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的nrf2激动肽(psrilyg)，pro-ser-arg-ile-leu-tyr-gly的制备方法，其包括以下步骤：

3、a)酶解：取龙头鱼骨胶原蛋白，加入蒸馏水中混合均匀，利用木瓜蛋白酶进行酶解，ph8.0、温度55℃，水解4h，酶解完成后水浴煮沸10min灭活，离心取上清液调节ph至中性；

4、b)过滤：将酶解液经过0.22μm滤膜过滤，再利用分子量为1kda超滤膜过滤，将滤液冷冻干燥，得冻干粉；

5、c)sephadex g-15凝胶层析：将90mg的步骤b)中的冻干粉溶于3ml蒸馏水中，上sephadexg-15凝胶柱进行分离，洗脱液为蒸馏水，洗脱液流速为0.3ml/min，每管收集时间为3min，每100管为一个循环，将试管中收集的洗脱液置于微量比色皿中，于280nm波长处测定紫外吸收值，合并吸光值最强的几管收集液，冷冻干燥，测定各峰dpph·清除率，选取清除活性最高的成分进行后续分离；

6、d)全自动高压制备分离：将步骤c)中活性最高的组分配成1mg/ml的溶液，用0.22μm滤膜过滤，流动相为水和乙腈(含0.1％三氟乙酸)，乙腈的洗脱梯度为10％～95％，进样量为5ml，流速为3.0ml/min，洗脱时间为90min，检测波长设置为215和280nm；收集洗脱峰，冷冻干燥；通过lc-ms/ms分析确定所得的寡肽序列为pro-ser-arg-ile-leu-tyr-gly。

7、在一些实施方式中，所述步骤a)中所述龙头鱼骨胶原蛋白的制备包括以下步骤：将鱼骨剪碎，除去非胶原物质、脱钙处理、去脂肪处理及提取鱼胶原蛋白步骤。

8、在一些实施方式中，所述步骤a)中所述龙头鱼骨胶原蛋白的制备包括以下步骤：将处理好的鱼骨剪碎，按1:20(g/ml)的料液比用0.1mol/l naoh溶液搅拌鱼骨48h，中间换液4次，用来除去非胶原物质，蒸馏水洗至中性；接着按1:20(g/ml)的料液比将鱼骨浸泡于浓度为0.5mol/l乙二胺四乙酸二钠盐溶液中搅拌48h进行脱钙处理，中途换液4次，处理完后清洗数遍；然后按1:20(g/ml)的料液比用15％的异丙醇溶液搅拌鱼骨直至除去鱼骨中的脂肪，然后将异丙醇清洗干净，整个实验过程均在4℃下进行；按1:30(g/ml)料液比加入0.5mol/l乙酸溶液(含重量比0.5％的胃蛋白酶)在4℃搅拌一天提取鱼骨胶原蛋白，提取结束后用脱脂棉纱布过滤，按上述方法反复提取两次，合并滤液；向滤液中加入nacl溶液进行盐析并不断搅拌至无沉淀洗出，将悬浊液在4℃、12000r/min的条件下离心，离心管底部的沉淀复溶于0.5mol/l乙酸溶液，最后装入透析袋透析至中性，冷冻干燥，制得鱼胶原蛋白。

9、在一些实施方式中，所述步骤a)中龙头鱼骨胶原蛋白与蒸馏水的重量体积比g/ml为8：500。

10、在一些实施方式中，所述步骤a)中木瓜蛋白酶的添加量为5500u/g。

11、在一些实施方式中，所述步骤c)中冻干粉与蒸馏水的重量体积比mg/ml为30:1。

12、本发明通过酶解龙头鱼骨胶原蛋白，再利用凝胶层析和液质联用等技术分离鉴定获得新型寡肽pro-ser-arg-ile-leu-tyr-gly(psrilyg)；该寡肽有显著的抗氧化活性，能激活nrf2通路从而保护细胞免受氧化损伤。

技术特征：

1.一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的nrf2激动肽，其特征在于所述激动肽的序列为：pro-ser-arg-ile-leu-tyr-gly，该激动肽有显著的抗氧化活性，能激活nrf2通路从而保护细胞免受氧化损伤。

2.一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的nrf2激动肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

3.如权利要求2所述一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的nrf2激动肽的制备方法，其特征在于所述步骤a)中所述鱼胶原蛋白的制备包括以下步骤：将鱼骨剪碎，除去非胶原物质、脱钙处理、去脂肪处理及提取鱼胶原蛋白步骤。

4.如权利要求2所述一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的nrf2激动肽的制备方法，其特征在于所述步骤a)中所述鱼胶原蛋白的制备包括以下步骤：将处理好的鱼骨剪碎，按1:20(g/ml)的料液比用0.1mol/l naoh溶液搅拌鱼骨48h，中间换液4次，用来除去非胶原物质，蒸馏水洗至中性；接着按1:20(g/ml)的料液比将鱼骨浸泡于浓度为0.5mol/l乙二胺四乙酸二钠盐溶液中搅拌48h进行脱钙处理，中途换液4次，处理完后清洗数遍；然后按1:20(g/ml)的料液比用15％的异丙醇溶液搅拌鱼骨直至除去鱼骨中的脂肪，然后将异丙醇清洗干净，整个实验过程均在4℃下进行；按1:30(g/ml)料液比加入0.5mol/l乙酸溶液(含重量比0.5％的胃蛋白酶)在4℃搅拌一天提取鱼骨胶原蛋白，提取结束后用脱脂棉纱布过滤，按上述方法反复提取两次，合并滤液；向滤液中加入nacl溶液进行盐析并不断搅拌至无沉淀洗出，将悬浊液在4℃、12000r/min的条件下离心，离心管底部的沉淀复溶于0.5mol/l乙酸溶液，最后装入透析袋透析至中性，冷冻干燥，制得鱼胶原蛋白。

5.如权利要求2所述一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的nrf2激动肽的制备方法，其特征在于所述步骤a)中龙头鱼骨胶原蛋白与蒸馏水的重量体积比g/ml为8：500。

6.如权利要求2所述一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的nrf2激动肽的制备方法，其特征在于所述步骤a)中木瓜蛋白酶的添加量为5500u/g。

7.如权利要求2所述一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的nrf2激动肽的制备方法，其特征在于所述步骤c)中冻干粉与蒸馏水的重量体积比mg/ml为30:1。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种来源于龙头鱼骨胶原蛋白的Nrf2激动肽。Pro‑Ser‑Arg‑Ile‑Leu‑Tyr‑Gly，该寡肽有显著的抗氧化活性，能激活Nrf2通路从而保护细胞免受氧化损伤。

技术研发人员：沈思珏,阮丹妮,徐芷源,金火喜
受保护的技术使用者：浙江海洋大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12