一种稳定表达人源KREMEN1受体的Vero细胞及其应用

本发明属于疫苗制备，特别涉及一种稳定表达人源kremen1受体的vero细胞及其应用。

背景技术：

1、手足口病常见于6岁以下婴幼儿，能够引起手、足、口等部位疱疹，也可以造成疱疹性咽颊炎、心肌炎、脑炎，严重者可导致死亡。引起手足口病的主要病原体包括ev71、cva16、cva6、cva10、evd68等多种肠道病毒。ev71曾是引起手足口病，尤其是重症的主要病原体。2016年，ev71疫苗成功上市，广泛接种该疫苗使得ev71引起的手足口病病例显著下降。但是，ev71疫苗对引起手足口病的其他病原体并无交叉保护作用。目前手足口病的流性特征逐渐转变为cva16、cva6、cva10等柯萨奇病毒占主导，多种肠道病毒共存。所以，研制针对cva10等柯萨奇病毒的疫苗对于全面防控手足口病尤为重要。

2、手足口病疫苗的开发策略主要包括：灭活、减毒、亚单位、vlp、核酸疫苗。借鉴ev71的成功经验，人们首先尝试灭活cva10疫苗的开发。目前cva10病毒疫苗研发遇到的难点主要是：cva10病毒在疫苗生产常用细胞(比如vero细胞)上的分离和增殖能力不强。对于疫苗研发，分离和培养病毒是第一步。根据目前报道，cva10等病毒分离多采用的是rd细胞。rd细胞属于肿瘤细胞，通过该细胞分离培养的病毒不可以用于疫苗生产。再者，细胞适应性的病毒不仅是疫苗生产的原料，也是评价疫苗保护效果的攻毒用毒株，而cva10在rd或vero细胞上的增殖能力也有待提高。可见，缺乏易感的疫苗生产用细胞是当前限制疫苗研发的关键问题。

3、因此，如何能够获得符合疫苗研发要求的更适用于cva10病毒培养的细胞系，是一个需要解决的问题。

技术实现思路

1、为了克服cva10病毒在vero细胞增殖不理想的问题，本发明的目的在于提供一种稳定表达人源kremen1受体的vero细胞及其应用，提高cva10病毒在vero细胞上的增殖能力。

2、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

3、一种稳定表达人源kremen1受体的新型vero细胞在柯萨奇病毒a10培养中的用途，所述新型vero细胞稳定表达人源kremen1受体。

4、进一步的，所述新型vero细胞的构建方法包括以下步骤：

5、步骤1，载体构建：

6、合成人源kremen1基因片段，在vero细胞中表达人kremen1基因，采用广谱性efs启动子，构建hkremen1慢病毒过表达载体；

7、所述人源kremen1基因片段的序列如seq id no.1所示；

8、步骤2，病毒包装：

9、将步骤1构建得到的hkremen1慢病毒过表达载体，导入慢病毒包装细胞中进行转染，完成病毒包装，产生高滴度含人源kremen1基因的慢病毒；

10、步骤3，稳转细胞筛选：

11、将上述高滴度含人源kremen1基因的慢病毒加至vero细胞中，并在转染一定时间后，利用嘌呤霉素进行筛选，从而获得稳定转染人源kremen1的新型vero细胞。

12、进一步的，步骤1构建得到的hkremen1慢病毒过表达载体为重组质粒：lv-efs＞hkremen1-cmv＞egfp/t2a/puro。

13、进一步的，步骤2所述慢病毒包装细胞为293t细胞。

14、本发明的另一方面：

15、上述稳定表达人源kremen1受体的新型vero细胞在制备疫苗中的应用。

16、进一步的，所述疫苗对cva10病毒引起的手足口病具有预防保护作用。

17、本发明相比现有技术的有益效果为：

18、本发明构建了稳定表达人源kremen1受体的新型vero细胞，并发现在所述新型vero细胞上，cva10病毒比在原始vero细胞具有更优的增殖特性，为手足口病疫苗研发奠定了良好基础，有利于疫苗制备及其有效性的评价。

技术特征：

1.一种稳定表达人源kremen1受体的新型vero细胞在柯萨奇病毒a10培养中的用途，其特征在于：所述新型vero细胞稳定表达人源kremen1受体。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述新型vero细胞的构建方法包括以下步骤：

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤1构建得到的hkremen1慢病毒过表达载体为重组质粒：lv-efs>hkremen1-cmv>egfp/t2a/puro。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤2所述慢病毒包装细胞为293t细胞。

5.一种如权利要求1所述稳定表达人源kremen1受体的新型vero细胞在制备疫苗中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述疫苗对cva10病毒引起的手足口病具有预防保护作用。

技术总结
本发明提供了一种稳定表达人源KREMEN1受体的Vero细胞及其应用，本发明使用慢病毒技术，在非洲绿猴肾细胞（Vero）中过表达人KREMEN1基因，构建了稳定表达人源KREMEN1（hKREMEN1）受体的新型Vero细胞。实验证明：柯萨奇病毒A10在该细胞系上比在原始Vero细胞具有更优的增殖特性。

技术研发人员：岳磊,谢忠平,李华,谢天宏,杨婷,向虹,王杰,高微捷,严敏
受保护的技术使用者：中国医学科学院医学生物学研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15