用于LAMP扩增的显色试剂及扩增体系和检测试剂盒的制作方法

本发明属于生物检测，具体涉及一种用于lamp扩增的显色试剂及扩增体系和检测试剂盒。

背景技术：

1、环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification，lamp)是一种恒温扩增技术，该技术依赖bst链置换酶，在60-65℃条件下1h内即可完成扩增，在添加环引物加速后可以进一步缩短扩增时间到10-30min。

2、lamp技术因其条件简单反应迅速的特点，搭配显色反应能快速得到试验结论，因此根据反应的特点衍生出许多种显色方法，大致包括以下几类：

3、a)金属离子反应类：钙黄绿素(锰离子)、羟基溴酚蓝(镁离子)

4、缺点：依赖离子显色，离子浓度过高会抑制反应。颜色变化不明显，肉眼难以判断弱阳性颜色，会造成误读，金属离子浓度不合适可能导致反应前后不变色。

5、b)ph指示剂类：中性红、甲酚红、苯酚红

6、区别：不同染料颜色变化的ph范围不同，颜色变化程度不同。其中苯酚红的颜色变化区域契合lamp扩增的适宜ph范围，且颜色变化相较其他染料更加明显，变色范围ph：6.8(黄)-8.4(红)。ph指示剂受lamp反应体系影响较大，需要调试研发适合的反应缓冲液才能保证变色体系正常工作。

技术实现思路

1、本发明的目的是，提供一种用于lamp扩增的显色试剂及扩增体系和检测试剂盒。旨在解决现有的lamp显色技术阴阳性颜色难以分辨的问题。

2、本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

3、一种用于lamp扩增的显色试剂，所述显色试剂包括苯酚红和不含tris-hcl的缓冲液，显色试剂各组分在lamp扩增体系中的组成为：50-150um苯酚红，5-10mm硫酸铵，5-15mmkcl。

4、作为优选实施方案，所述苯酚红在扩增体系中的浓度为60-100um。

5、本发明还提供一种lamp扩增体系，该扩增体系的组成为：50-150um苯酚红，5-10mm硫酸铵，5-15mm kcl，0.7-4mm dntp，0.01～2um引物对f3、b3，0.1～5um引物对fip、bip，0.01～4um引物对lf、lb，5-10u bst酶，1-15urna酶抑制剂，10-60u反转录酶，0.1-4mm柠檬酸钠，6-10mm mgso4和/或mgcl2。所述dntp包括datp、dgtp、dttp(或dutp)、dctp，当检测rna样本例如新冠核酸时，dttp更改为dutp；所述0.7-1.4mm dntp是指dntp的总浓度范围。0.01～2um引物对f3、b3，0.1～5um引物对fip、bip，0.01～4um引物对lf、lb，这里是指每条引物的浓度范围。

6、作为优选实施方案，所述扩增体系还包括荧光染料，用于通过荧光pcr检测扩增曲线。

7、作为优选实施方案，所述荧光染料为syto9，其在扩增体系中的浓度为0.5-5um，优选1-3um。

8、作为优选实施方案，该扩增体系的组成为：60-100um苯酚红，5-8mm硫酸铵，5-10mmkcl，1.0-1.4mm dntp，0.1-0.2um引物对f3、b3，1.2-1.6um引物对fip、bip，0.4-0.8um引物对lf、lb，6-8u bst酶，5-12u rna酶抑制剂，30-40u反转录酶，0.4-1mm柠檬酸钠，7-9mmmgso4和/或mgcl2。

9、本发明还提供一种lamp检测试剂盒，该检测试剂盒包括所述的lamp扩增体系。

10、作为优选实施方案，所述检测试剂盒用于检测新型冠状病毒covid-19、肺炎支原体。

11、作为优选实施方案，所述检测试剂盒用于检测新型冠状病毒covid-19时，采用的引物组为以下三对引物，

12、引物对n-3f3/n-3b3，其中n-3f3的核苷酸序列如seq id no.1所示，n-3b3的核苷酸序列如seq id no.2所示；

13、引物对n-3fip/n-3bip，其中，n-3fip的核苷酸序列如seq id no.3所示，n-3bip的核苷酸序列如seq id no.4所示；

14、引物对n-3lf/n-3lb，其中，n-3lf的核苷酸序列如seq id no.5所示，n-3lb的核苷酸序列如seq id no.6所示。

15、作为优选实施方案，所述检测试剂盒用于检测新型冠状病毒covid-19时，对样本进行裂解处理后直接进行lamp扩增；所述裂解处理的裂解液组成为：0.1-2％triton x-100，0.1-2％tween-20，0.1-2％tergitol(type np-40)，30-300mm盐酸胍，30-300mm尿素，10-100mg/ml chelex，0.1-10mm tcep。

16、作为优选实施方案，所述裂解液的组成为：0.5-1％triton x-100，0.5-1％tween-20，0.5-1％tergitol(type np-40)，50-150mm盐酸胍，50-150mm尿素，50-80mg/ml chelex，1-5mm tcep。

17、本发明中涉及的英文缩写注释如下：

18、lamp：环介导等温扩增技术

19、tris-hcl：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐

20、dntp：datp、dgtp、dttp(或dutp)、dctp的统称

21、triton x-100：聚乙二醇叔辛基苯基醚

22、tween-20：吐温-20

23、tergitol：type np-40，壬基酚聚氧乙烯醚

24、chelex：螯合树脂

25、tcep：三(2-羧乙基)膦盐酸盐

26、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

27、1，lamp中显色指示剂苯酚红的变色是因为扩增反应前后ph的变化，反应体系中的缓冲成分使得ph变化不明显，因此导致苯酚红变色不明显不完全。本发明通过研究发现：去除lamp反应体系中的缓冲成分tris-hcl后，试验过程中并未出现扩增反应的异常；产生的优势是反应体系颜色变化明显，阴性和阳性样本的显色差异更加显著。本发明的lamp扩增体系能够在保证扩增性能的同时为变色反应提供良好的条件。

28、2，本发明扩增体系采用的lamp引物不含特殊标记，订购成本低；现有的neb lamp显色试剂盒单人份成本价格在25元左右，本发明检测试剂单人份成本价格在5元左右。

29、3，本发明提供的检测试剂盒检测操作简单速度快，能够满足大量样本例如新冠检测的需求。

技术特征：

1.一种用于lamp扩增的显色试剂，其特征在于，所述显色试剂包括苯酚红和不含tris-hcl的缓冲液，显色试剂各组分在lamp扩增体系中的组成为：50-150um苯酚红，5-10mm硫酸铵，5-15mm kcl。

2.如权利要求1所述的用于lamp扩增的显色试剂，其特征在于：所述苯酚红在扩增体系中的浓度为60-100um。

3.一种lamp扩增体系，其特征在于，该扩增体系的组成为：50-150um苯酚红，5-10mm硫酸铵，5-15mm kcl，0.7-4mm dntp，0.01～2um引物对f3、b3，0.1～5um引物对fip、bip，0.01～4um引物对lf、lb，5-10u bst酶，1-15u rna酶抑制剂，10-60u反转录酶，0.1-4mm柠檬酸钠，6-10mm mgso4和/或mgcl2。

4.如权利要求3所述的lamp扩增体系，其特征在于：所述扩增体系还包括荧光染料，用于通过荧光pcr检测扩增曲线。

5.如权利要求4所述的lamp扩增体系，其特征在于：所述荧光染料为syto9，其在扩增体系中的浓度为0.5-5um。

6.如权利要求3所述的lamp扩增体系，其特征在于，该扩增体系的组成为：60-100um苯酚红，5-8mm硫酸铵，5-10mm kcl，1.0-1.4mm dntp，0.1-0.2um引物对f3、b3，1.2-1.6um引物对fip、bip，0.4-0.8um引物对lf、lb，6-8u bst酶，5-12u rna酶抑制剂，30-40u反转录酶，0.4-1mm柠檬酸钠，7-9mm mgso4和/或mgcl2。

7.一种lamp检测试剂盒，该检测试剂盒包括权利要求3-6任一项所述的lamp扩增体系。

8.如权利要求7所述的lamp检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒用于检测新型冠状病毒covid-19、肺炎支原体。

9.如权利要求8所述的lamp检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒用于检测新型冠状病毒covid-19时，采用的引物组为以下三对引物，

10.如权利要求8所述的lamp检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒用于检测新型冠状病毒covid-19时，对样本进行裂解处理后直接进行lamp扩增；所述裂解处理的裂解液组成为：0.1-2％triton x-100，0.1-2％tween-20，0.1-2％tergitol，30-300mm盐酸胍，30-300mm尿素，10-100mg/ml chelex，0.1-10mm tcep。

11.如权利要求10所述的lamp检测试剂盒，其特征在于，所述裂解液的组成为：0.5-1％tritonx-100，0.5-1％tween-20，0.5-1％tergitol，50-150mm盐酸胍，50-150mm尿素，50-80mg/ml chelex，1-5mm tcep。

技术总结
本发明公开了一种用于LAMP扩增的显色试剂及扩增体系和检测试剂盒。所述显色试剂包括苯酚红和不含Tris‑HCl的缓冲液，显色试剂各组分在LAMP扩增体系中的组成为：50‑150uM苯酚红，5‑10mM硫酸铵，5‑15mMKCl。LAMP中显色指示剂苯酚红的变色是因为扩增反应前后PH的变化，反应体系中的缓冲成分使得PH变化不明显，因此导致苯酚红变色不明显不完全。本发明发现：去除LAMP反应体系中的缓冲成分Tris‑HCl后，并未出现扩增反应的异常；产生的优势是反应体系颜色变化明显，阴性和阳性样本的显色差异更加显著。本发明的LAMP扩增体系能够在保证扩增性能的同时为变色反应提供良好的条件。

技术研发人员：高鹏飞,王丽娟,严俊
受保护的技术使用者：上海思路迪生物医学科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15