一种无血清培养基及其在杂交瘤细胞体外培养中的应用的制作方法

1.本发明涉及单克隆抗体技术领域，具体涉及一种无血清培养基及其在杂交瘤细胞体外培养中的应用。


背景技术：

2.单克隆抗体在体外诊断和疾病治疗等方面具有非常广泛的应用，它具有特异性高、效价高、纯度高、理化性状均一、重复性强、成本低并可大量生产等优点，目前单克隆抗体的单克隆抗体的制备主要采用体内法，将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，杂交瘤细胞在小鼠腹腔内生长，并产生腹水，因而可得到大量的且抗体浓度很高腹水单抗，但腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白(包括igg)和脂类物质等，在很多情况下必须要提纯后才能使用，还有动物病毒污染的危险，另外由于小鼠个体差异较大，导致产品批间差较大。因此在无/低血清条件下的杂交瘤细胞的体外大量培养成为当前研究的主要方向；
3.现阶段杂交瘤细胞体外培养生产单克隆抗体与体内诱生腹水法生产单抗相比产量低，市售无血清培养基价格较高产量低，本发明的培养基通过调整配方，优化体外培养工艺方案使杂交瘤体外培养稳定高浓度表达。


技术实现要素：

4.本发明的目的就在于解决上述背景技术的问题，而提出一种无血清培养基及其在杂交瘤细胞体外培养中的应用。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
6.一种无血清培养基，包括以下重量份原料：1份dmem培养基、1份ham’sf-12培养基和1份rpmi1640培养基，该无血清培养基还包括以下原料：牛血清白蛋白50μg/ml、胰岛素10μg/ml、转铁蛋白20μg/ml、乙醇胺5μg/ml、亚硒酸钠5ng/ml、水解小麦谷蛋白0.15g/l、大豆水解蛋白0.15g/l、谷氨酰胺2mmol/l和氯化胆碱3mg/l。
7.作为本发明进一步的方案：基于无血清培养基杂交瘤细胞体外培养方法，包括以下步骤：
8.步骤1：利用特异性抗原免疫balb/c小鼠，elisa检测免疫血清效价超过1/100000后，分离小鼠的脾脏细胞，将小鼠脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞sp2/0融合，利用hat进行选择性培养，利用elisa方法筛选出特异性阳性杂交瘤细胞株，并将阳性克隆杂交瘤细胞株进行克隆化培养获得单克隆杂交瘤细胞株；
9.步骤2：按照上述原料制备无血清培养基；
10.步骤3：将获得的单克隆杂交瘤细胞株进行无血清驯化，选择对数生长期，活率大于90％活细胞，调整细胞密度密度达到1
×
106个/ml，利用上步配制的无血清培养基进行直驯化；
11.步骤4：选择上步驯化成功的处于对数生长期，活率大于90％活细胞进行传代测试，调整细胞密度密度1
×
106个/ml每天更换新无血清培养基进行传代培养；
12.步骤5：选择驯化成功的处于对数生长期，活率大于90％活细胞进行测定培养基生长曲线，调整细胞密度1
×
106个/ml更换全新配制的无血清培养基，培养体积20ml，在转速130rpm摇床培养，每天统计细胞密度及活率直至细胞活率降至10％以下，获得无血清培养基最大细胞培养密度。
13.作为本发明进一步的方案：驯化成功的标准：每2-3天，活细胞密度可达2
×
106个/ml，细胞活率在90％以上，细胞的比生长速率与驯化前一致。
14.作为本发明进一步的方案：小鼠脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞sp2/0融合，包括以下步骤：
15.按照重量比为脾细胞:骨髓瘤＝5：1进行混合，1200rpm离心3分钟；将离心上清倒干，把沉淀细胞块弹成糊状，在1分钟内加入1ml融合剂，并搅拌细胞，室温放置90秒，加入pbs进行终止；将细胞弹匀，加入dmem培养液，再加入饲养细胞、hat、谷氨酰胺和血清，将细胞重悬，轻轻地将之混匀，加到20个96孔细胞培养板中。
16.作为本发明进一步的方案：筛选出特异性阳性杂交瘤细胞株，包括以下步骤：
17.步骤11：抗原包被：用包被液将抗原浓度稀释至1μg/ml，取100μl加入聚苯乙烯酶联检测板各孔中，4℃放置过夜，弃去板中样品，洗板机洗涤2次,将酶标板甩干；
18.步骤21：封闭：每孔加150μl封闭液，37℃孵育2小时，洗板机洗涤3次，拍板机甩干；置4℃冰箱保存备用；
19.步骤31：elisa检测。
20.作为本发明进一步的方案：elisa检测方法，包括以下步骤：
21.加待测样品：检测融合板时，无菌条件下取细胞上清，50-100μl/孔加样到包被好的酶标板中，同时，每板选取无细胞生长的1孔为阴性对照，另选取无细胞生长的1孔加入阳性血清作为阳性对照；37℃孵育40min，洗板机洗涤5次，拍板机甩干；
22.加二抗：用抗体稀释液将hrp标记的山羊抗小鼠二抗稀释10000倍，100μl/孔，37℃孵育30min，洗板机洗涤5次，拍板机甩干；
23.显色：将底物显色液a、b液等体积混合，每孔加入100ul混合液，37℃显色5min；
24.终止：加入终止液50μl/孔；
25.读数：以450nm单波长测定各孔od值，以与阴性对照孔od值的比值大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点。
26.作为本发明进一步的方案：杂交瘤细胞的克隆化培养方法，包括以下步骤：
27.细胞计数：将阳性孔杂交细胞重悬后计数，配制含饲养细胞的20％fbs-dmem-ht培养基，用培养基将杂交瘤按12个细胞/ml密度制成细胞悬液，制备5ml；
28.铺板：每个克隆铺0.5块96孔板，以0.1ml/孔(即1.2个/孔)加入培养板培养，每个克隆的剩余细胞应冻存保种；
29.挑选单克隆：约7天左右在显微镜下挑选单克隆孔，进行标记与记录，elisa检测抗体，阳性孔进行换液，次日复检确认后，挑选2个细胞状态最好的孔进行扩大培养。
30.一种由上述制备得到的无血清培养基应用于杂交瘤细胞体外培养中。
31.本发明的有益效果：
32.本发明通过balb/c小鼠脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞sp2/0融合来源的杂交瘤细胞在本发明无血清培养基中可无限传代增殖；杂交瘤细胞在本发明无血清培养基中最高细胞
生长密度显著高于市售无血清培养基，细胞高密度培养可大幅度提高抗体产量；因无动物血清成分，提高生产抗体纯度，降低抗体纯化难度。
具体实施方式
33.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
34.实施例1
35.本发明为一种无血清培养基及其在杂交瘤细胞体外培养中的应用，
36.包括以下重量份原料：1份dmem培养基、1份ham’sf-12培养基和1份rpmi1640培养基，该无血清培养基还包括以下原料：牛血清白蛋白50μg/ml、胰岛素10μg/ml、转铁蛋白20μg/ml、乙醇胺5μg/ml、亚硒酸钠5ng/ml、水解小麦谷蛋白0.15g/l、大豆水解蛋白0.15g/l、谷氨酰胺2mmol/l和氯化胆碱3mg/l；
37.一种基于无血清培养基杂交瘤细胞体外培养方法，包括以下步骤：
38.步骤1：抗人igg单克隆抗体杂交瘤细胞的制备
39.将人igg与弗氏完全佐剂1:1充分混合乳化，皮下多点注射皮下多点注射免疫6-8周龄雌性balb/c小鼠(每只小鼠200微升，每点约40微升)；两周后用弗氏不完全福氏佐剂与人igg溶液按1:1的比例混合乳化，腹腔注射加强免疫小鼠；两周后用弗氏不完全福氏佐剂与人igg溶液按1:1的比例混合乳化，腹腔注射二次加强免疫小鼠。两周后取血测定抗体的效价，经腹腔冲击免疫小鼠，三天后取小鼠处死脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0细胞以50％peg介导融合。然后在含hat的培养基进行选择培养；包被人igg包被板利用间接elisa法检测融合细胞上清，选取阳性孔5e4进行亚克隆培养直至单克隆细胞孔阳性率100％，扩大培养阳性细胞株鼠抗人igg-5e4冻存保种；
40.步骤2：无血清培养基配制
41.将dmem培养基、ham’sf-12培养基和rpmi1640培养基三者按照1:1:1比例配置成基础培养基，添加牛血清白蛋白50μg/ml、胰岛素10μg/ml、转铁蛋白20μg/ml、乙醇胺5μg/ml、亚硒酸钠5ng/ml、水解小麦谷蛋白0.15g/l、大豆水解蛋白0.15g/l、谷氨酰胺2mmol/l、氯化胆碱3mg/l等，配制成无血清培养基；
42.步骤3：细胞无血清驯化
43.复苏细胞鼠抗人igg-5e4，将获得的单克隆杂交瘤细胞株5e4进行无血清驯化，选择对数生长期，活率大于90％活细胞，调整细胞密度密度达到1
×
106个/ml，利用上步配制的无血清培养基进行直接驯化，每2-3天，活细胞密度可达2
×
106个/ml，细胞活率在90％以上，细胞的比生长速率与驯化前一致；
44.步骤4：细胞传代测试
45.选择上步驯化成功的处于对数生长期，活率大于90％细胞鼠抗人igg-5e4进行传代测试，调整细胞密度密度1
×
106个/ml每天更换新无血清培养基进行传代培养，测定每一代细胞密度及活率基本保持一致，结果见表1，细胞鼠抗人igg-5e4在无血清培养基中可无限增殖；
46.表1
[0047][0048]
步骤5：生物反应器培养
[0049]
选择ba-7l发酵罐作为本次培养细胞表达抗体的生物反应器，本发明无血清培养基为发酵液，将种子细胞鼠抗人igg-5e4培养至2*t225方瓶+8*t225方瓶，取细胞接种ba-7l罐，接种体积1.6l，培养设置参数：溶氧为：50，ph：7.0，温度：37℃，转速：80转/min，上罐后培养每间隔12h，取样观察细胞状态，并计数细胞数量和细胞密度，测残糖含量，根据细胞实际情况调整补液及发酵方案，最终培养体积达到5l，最大细胞密度8
×
106个/ml，发酵液抗体纯化得率0.64mg/ml。
[0050]
发酵过程见表2：
[0051]
表2
[0052][0053]
实施例2
[0054]
基于上述实施例1，小鼠处死脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0细胞以50％peg介导融合，包括以下步骤：
[0055]
步骤1：饲养细胞制备：
[0056]
a.将balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75％酒精5分钟，随即放入超净工作台内，腹部朝上固定于解剖板上；
[0057]
b.用眼科镊子夹起小鼠腹部皮肤，用剪刀剪一小口，注意切勿剪破腹膜，以免腹腔液外流。然后用剪刀向上下两侧做钝性分离，充分暴露腹膜；用酒精棉球擦拭腹膜消毒；
[0058]
c.用注射器吸取5mldmem基础培养液，注入小鼠腹腔，取出注射器，用镊子在小鼠腹部轻压数次，剪开腹膜，用移液器吸取腹腔细胞至离心管中备用；
[0059]
步骤2：脾细胞制备：取加强免疫小鼠一只，眼眶采血后脱臼处死，在75％酒精中消毒后取脾脏，去除结缔组织，在10cm培养皿中加入30ml无菌pbs，将细胞筛放于培养皿中，将脾脏放于细胞筛，用研磨棒将脾脏碾碎，制备脾细胞悬液，转移到50ml离心管中，1200rpm离心3分钟，弃上清，重复洗涤两次，加pbs至30ml重悬，取少量细胞，用pbs稀释50倍，计数，取1
×
108个细胞待用；
[0060]
步骤3：骨髓瘤细胞制备：取4皿生长状态良好的(活细胞数》95％)骨髓瘤细胞，将之完全吹下，转移到50ml离心管中，加pbs至30ml，1200rpm离心3分钟，弃上清，重复洗涤两次，加pbs至30ml重悬，pbs稀释20倍，计数，取2
×
107个细胞待用；
[0061]
步骤4：细胞混合：脾细胞:骨髓瘤＝5：1，混合，1200rpm离心3分钟；
[0062]
注意：由于细胞融合是个随机过程，母细胞比例不一，会影响融合产物；或是两种母细胞融合而成的杂交细胞，或是一种细胞自身融合产物。多数实验者采用骨髓瘤细胞：脾细胞＝1：5，也有人采取其他比例，如骨髓瘤细胞：脾细胞＝1：5，甚至是1：1。减少脾细胞用量目的是降低脾细胞自身融合的机率；
[0063]
步骤5：细胞融合：将离心上清倒干，把沉淀细胞块弹成糊状，在1分钟内加入1ml融合剂，并搅拌细胞，室温放置90秒，加入pbs进行终止；
[0064]
步骤6：细胞培养：轻轻将细胞弹匀，缓缓加入少量dmem培养液，加入饲养细胞、hat(1x终浓度)、谷氨酰胺(1x终浓度)、血清(20％终浓度)，将细胞重悬，轻轻地将之混匀，加到20个96孔细胞培养板中；排枪滴加100微升(配10ml/板)，37℃，co2培养箱培养、观察；
[0065]
步骤7：细胞培养、换液：细胞融合后第一天开始，对细胞进行仔细观察，记录好细胞的生长状态、每孔杂交细胞瘤个数、培养液有无污染、饲养细胞的状况；培养5-7天进行一次全换液，更换为ht培养液。
[0066]
实施例3
[0067]
阳性杂交瘤细胞筛选方法，包括以下步骤：
[0068]
步骤1：抗原包被：用包被液将抗原浓度稀释至1μg/ml，取100μl加入聚苯乙烯酶联检测板各孔中，4℃放置过夜，弃去板中样品，洗板机洗涤2次,将酶标板甩干；
[0069]
步骤2：封闭：每孔加150μl封闭液，37℃孵育2小时，洗板机洗涤3次，拍板机甩干；置4℃冰箱保存备用；
[0070]
步骤3：elisa检测
[0071]
加待测样品：检测融合板时，无菌条件下取细胞上清，50-100μl/孔加样到包被好的酶标板中，同时，每板选取无细胞生长的1孔为阴性对照，另选取无细胞生长的1孔加入阳性血清(1:1000稀释)作为阳性对照；37℃孵育40min，洗板机洗涤5次，拍板机甩干；
[0072]
加二抗：用抗体稀释液将hrp标记的山羊抗小鼠二抗稀释10000倍，100μl/孔，37℃孵育30min，洗板机洗涤5次，拍板机甩干；
[0073]
显色：将底物显色液a、b液等体积混合，每孔加入100ul混合液，37℃显色5min；
[0074]
终止：加入终止液50μl/孔；
[0075]
读数：以450nm单波长测定各孔od值，以与阴性对照孔od值的比值(p/n)大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点；
[0076]
步骤4：elisa复检
[0077]
将96孔细胞培养板中上述检测阳性的孔进行标记与记录，吸弃孔中培养基，加入100ul新鲜培养基(20％fbs-dmem，1xht)，放入培养箱培养过夜；重复步骤3，对检测的阳性孔进行二次确认。
[0078]
实施例4
[0079]
杂交瘤细胞的克隆化培养方法，包括以下步骤：
[0080]
步骤1：实验材料与试剂准备
[0081]
灭菌手术器械；96孔细胞培养板；10cm细胞培养皿；15ml无菌离心管；50ml无菌离心管；细胞计数板；dmem高糖培养基；胎牛血清(fbs)；50xht母液；
[0082]
步骤2：实验操作
[0083]
制备饲养细胞：参考上述实施例2中的细胞融合sop的相关步骤；
[0084]
细胞计数：将阳性孔杂交细胞重悬后计数，配制含饲养细胞的20％fbs-dmem-ht培养基，用培养基将杂交瘤按12个细胞/ml密度制成细胞悬液，制备5ml；
[0085]
铺板：每个克隆铺0.5块96孔板，以0.1ml/孔(即1.2个/孔)加入培养板培养，每个克隆的剩余细胞应冻存保种；
[0086]
挑选单克隆：约7天左右在显微镜下挑选单克隆孔，进行标记与记录，elisa检测抗体，阳性孔进行换液，次日复检确认后，挑选2个细胞状态最好的孔进行扩大培养。
[0087]
实施例5
[0088]
本发明利用品系为balb/c小鼠脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞sp2/0融合来源的杂交瘤细胞均适应于本发明所得到的无血清培养基。
[0089]
本发明工作原理：本发明是基于常规无血清培养基基础配方的创造性改进。传统的无血清培养基即不加动物血清的培养基，虽然没有血清但为保证细胞的正常生长不受影响需加入一些促生长因子、转铁蛋白、胰岛素、动植物蛋白等成分。因培养基中加入了大量物质使得培养基中的成分不够明确，会对后期的抗体生产产生一定的影响。
[0090]
本发明所配制无血清培养基所添加的成分都是已知的且不含血清等未知的成分，培养基成分明确有利于细胞代谢情况的观察及后续抗体的分离纯化。这类培养基适用于利用传统杂交瘤制备方案制备的杂交瘤细胞株，此类细胞株在该培养基中培养会有较高的表达水平，可用于规模化工业化大量生产抗体，并有有利于抗体下游纯化从而提高抗体纯度简化工艺，产品批次间差异小，细胞培养重复性高，同时可减少由于血清所带来的内外源病毒、支原体以及细菌等微生物污染的风险。
[0091]
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。