昆虫m6A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因的dsRNA及其应用

昆虫m6a甲基化阅读蛋白elf3-s6基因的dsrna及其应用
技术领域
1.本发明涉及农业生物技术领域。具体涉及昆虫m6a甲基化阅读蛋白elf3-s6基因的dsrna及其应用。


背景技术：

2.农业害虫危害是制约我国农业产量的重要因素。目前，在害虫防治工作中，主要以化学防治为主，即化学杀虫剂。随着各类化学杀虫剂的长期大量使用，昆虫逐渐产生较高的抗药性从而降低防治效率，进一步促使化学杀虫剂的过度使用，造成严重的环境污染，对生态环境及粮食安全生产造成了巨大的损害。
3.化学防治技术的诸多问题已经使得人们不得不寻求开发新型的害虫防治方法。2006年获诺贝尔奖的rna干扰(rna interference，rnai)技术，是一种由双链rna分子介导的同源rna高效特异性沉默技术。rnai技术由于其对靶标基因沉默的特异性和高效性，自一出现便显示出强大的应用潜力，该技术为基因功能、人类疾病治疗和农作物害虫防治等方面的研究都开辟了新途径。基于rna干扰技术进行害虫防治具有如下特点：1)杀虫具有专一性，选择对害虫专一的基因进行干扰，对非靶标生物无杀伤作用；2)rna在自然界极易降解、无残留；3)对环境无毒无害，相对安全。因此rnai技术是一种理想的害虫种类特异的防治体系。
4.rna的m6a甲基化修饰作为表观遗传学研究的重要内容，承载着许多生物学功能。近几年的研究表明，在昆虫中，m6a甲基化修饰通过改变基因的表达方式，可以直接影响昆虫的发育分化。因此昆虫m6a甲基化修饰基因已被认为新型杀虫剂作用的靶标。m6a甲基化阅读蛋白在昆虫发育分化过程中起着关键作用，采用rna干扰技术，开展m6a甲基化阅读蛋白dsrna在害虫防治中的应用具有十分重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种调控昆虫蜕皮发育的m6a甲基化阅读蛋白elf3-s6基因dsrna及其应用。
6.本发明提供的一种昆虫m6a甲基化阅读蛋白elf3-s6基因片段1，其核苷酸序列是seq id no：1。获得方法包括以下步骤：基于昆虫的转录组数据库，采用生物信息学方法对昆虫m6a甲基化阅读蛋白elf3-s6基因进行搜索，经过序列分析和比对后，获得编码m6a甲基化阅读蛋白elf3-s6的核苷酸序列seq id no：1，设计上下游引物seq id no：3和seq id no：4，pcr扩增获得，命名为elf3-s6，其长度为1314bp，编码437个氨基酸。
7.本发明提供的一种昆虫m6a甲基化阅读蛋白elf3-s6基因片段2，其核苷酸序列是seq id no：2，是根据seq id no：1设计上游引物序列为seq id no：5和下游引物序列为seq id no：6，通过pcr扩增获得。进一步通过t7ribomax
tm express rnai system(promega)试剂盒体外转录合成elf3-s6基因的dsrna。
8.与现有技术相比，本发明的有益效果：
pcr clean-up system(promega)试剂盒纯化后，参照t7ribomax
tm express rnai system(promega)试剂盒说明体外转录合成dsrna，得到的dsrna用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测其单一性，以绿色荧光蛋白基因gfp为对照，合成dsgfp，使用nanodrop 2000进行定量至终浓度达到2.5μg/μl，保存于-80℃冰箱备用。
22.实施例4：飞蝗m6a甲基化阅读蛋白elf3-s6基因dsrna致死飞蝗试验
23.1)飞蝗m6a甲基化阅读蛋白elf3-s6基因dsrna注射
24.本发明选取大小一致、生长健康、雌雄各半4龄第1天飞蝗若虫作为实验对象。将2μl合成的dsrna用25μl规格微量注射器，顺着血液流动的方向，注射到若虫侧腹部第2-3腹节之间。注射剂量为5μg/头，并设置dsgfp(5μg)的对照组，实验组36头、对照组40头。注射完毕后，将飞蝗若虫饲养在通风良好的15cm
×
15cm
×
13cm的塑料网状笼内，饲养条件为光照：黑暗时间＝14h:10h，温度30
±
2℃，湿度60％，每天饲喂撒有麦麸的新鲜小麦幼苗。
25.2)飞蝗m6a甲基化阅读蛋白elf3-s6基因沉默效果检测
26.收集注射dsgfp和dself3-s6的飞蝗若虫，每组3只，雌雄各半，实验组和对照组均取6个生物学重复。采用trizol法提取总rna，采用primescript
tm rt reagent kit with gdna eraser反转录获得第一链cdna，利用real-time pcr方法分别检测目的基因elf3-s6和管家基因β-actin的相对表达量，对其沉默效率进行计算。如图1所示，结果表明，与对照组比较，注射dself3-s6后，实验组飞蝗m6a甲基化阅读蛋白elf3-s6基因表达显著降低，其沉默效率达99％。
27.3)注射dsrna后飞蝗表型的观察
28.如图2所示，4龄若虫注射dsrna后，对照组在8天后全部成功蜕皮至5龄，且蜕皮后生长发育状况良好。而实验组注射dself3-s6后，有34头无法成功蜕皮直至死亡，死亡率达到94.4％，同时有2头若虫可以成功蜕皮至下一龄期，但在5龄第3天时死亡。
29.4)注入dsrna后飞蝗死亡情况的观察
30.如图3所示，注射dsrna的飞蝗实验组死亡率为100％。这与注射dsgfp的对照组(死亡率为2.5％)相比，致死效果明显。


技术特征：
1.一种飞蝗m6a甲基化阅读蛋白elf3-s6基因片段1，其核苷酸序列是seq id no：1。2.一种飞蝗m6a甲基化阅读蛋白elf3-s6基因片段2，其核苷酸序列是seq id no：2。3.如权利要求2所述的一种飞蝗m6a甲基化阅读蛋白elf3-s6基因片段2合成的dsrna。4.如权利要求3所述的一种飞蝗m6a甲基化阅读蛋白elf3-s6基因片段2合成的dsrna在致死飞蝗中的应用。

技术总结
本发明提供一种昆虫m6A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因的dsRNA及其应用，首先对昆虫的m6A甲基化阅读蛋白elF3-S6基因进行克隆、测序后，得到序列为SEQ ID NO：1的编码m6A甲基化阅读蛋白elF3-S6的核苷酸序列，然后选择序列为SEQ ID NO：2的基因片段，由该片段合成dsRNA。通过RNA干扰技术，注射合成的dsRNA干扰昆虫elF3-S6基因的表达后，昆虫因蜕皮困难死亡。本发明为基于RNA干扰的害虫防治提供新的靶标。发明为基于RNA干扰的害虫防治提供新的靶标。发明为基于RNA干扰的害虫防治提供新的靶标。


技术研发人员：杨美玲 王慧敏 胡志豪
受保护的技术使用者：首都师范大学
技术研发日：2022.06.21
技术公布日：2022/9/8