环状核酸分子、其制备方法以及核酸探针和检测方法

1.本发明涉及分子检测技术领域，具体而言，涉及一种环状核酸分子、其制备方法以及核酸探针和检测方法。


背景技术：

2.滚环扩增rolling circle amplification(rca)是一种基于核酸的生物信号放大技术，能以环状核酸分子为模板，在聚合酶作用下将环状核酸分子复制上千上万倍，使得低浓度目标分子介导产生的信号放大从而能被检测。与目前最广泛应用的pcr技术相比，rca由于具有不需要热循环步骤以及不需要特殊的设备的优势，目前已经广泛应用于生物标志物的检测。构建超快速且高灵敏的rca技术对于床旁诊断(point-of-care testing,poct)和生物传感领域尤其重要。但现有的滚环扩增的效率较低。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种环状核酸分子、其制备方法以及核酸探针和检测方法。本发明提供的环状核酸分子仅含有三种碱基，具有最少二级结构，以此序列为模板进行rca，具有较高的扩增效率，可广泛适用于信号放大、纳米结构、生物传感、分子诊疗等领域。
4.本发明是这样实现的：
5.第一方面，本发明提供一种适用于rca反应作为模板获取长单链核酸分子的环状核酸分子，其不含碱基c，其线性核苷酸序列为(ggttattatt)n，其中n≥3，n为整数。
6.rca的扩增效率与环状模板的dna序列和二级结构有关。在此专利中，本发明提供了一种含有三种碱基的，且具有最少二级结构的dna环状核酸分子，并以此新型序列为模板进行rca具有较高的扩增效率，其可广泛适用于信号放大、纳米结构、生物传感、分子诊疗等领域，为快速高灵敏的rca信号放大技术提供了分子基础。
7.可选地，在一些实施例中，n＝4-6，优选地，n＝5。
8.可选地，在一些实施例中，所述环状核酸分子的线性核苷酸序列如seq id no.1所示：
9.ggttattattggttattattggttattattggttattattggttattatt。
10.第二方面，本发明提供一种用于制备如上所述的环状核酸分子的前体核酸分子，其为直链结构，其通过成环反应可以形成如上所述的环状核酸分子。
11.可选地，在一些实施例中，上述前体核酸分子的核苷酸序列为p-(ggttattatt)n，其中n≥3，n为整数，p为磷酸基团。
12.可选地，在一些实施例中，n＝4-6，优选地，n＝5。
13.第三方面，本发明提供如上所述的环状核酸分子的制备方法，其包括：成环反应步骤，
14.所述成环反应步骤包括：将如上所述的前体核酸分子置于成环反应体系中进行反应以获得所述环状核酸分子。
15.上述环状核酸分子的合成由5’端修饰了磷酸基团的上述前体核酸分子通过核酸单链连接酶的催化作用连接实现的。
16.可选地，在一些实施例中，上述制备方法还包括纯化步骤。例如成环反应步骤的连接产物通过page电泳后，利用sybr green
ꢀⅰ
后染法将核酸条带染荧光，并通过切胶仪将环状核酸模板切出，用page纯化试剂盒纯化环状核酸分子，得到纯的环状核酸分子。当然，本领域技术人员采取其他的纯化方法得到该环状核酸分子也属于本发明的保护范围。
17.可选地，在一些实施例中，所述成环反应体系含有环化连接酶、atp、氯化锰、以及缓冲液。
18.可选地，在一些实施例中，进行环化反应的条件为：58-62℃孵育0.5-1小时，80-99℃孵育8-12分钟使酶失活。
19.第四方面，本发明提供一种进行rca反应以获取长单链核酸分子的方法，其包括：使用如上所述的环状核酸分子作为模板进行rca反应。
20.例如，环状核酸分子加入rca反应混合物中产生具最少二级结构的长单链核酸分子。rca反应混合物包括聚合酶缓冲液、dntp、引物、核酸聚合酶。反应条件为37℃孵育(时间长短根据检测条件需求而定)，95℃孵育10分钟使其失活。
21.可选地，在一些实施例中，进行rca反应所用的引物序列如seq id no.4所示。由此引物经过rca反应可得到长单链核酸分子，其长度本领域技术人员可以根据实际需求通过调控反应时间等来控制。
22.第五方面，本发明提供由如上所述的方法得到的长单链核酸分子。
23.需要说明的是，该长单链核酸分子的长度可以根据本领域的需要通过控制rca反应的时间来控制，其长度对本领域技术人员来说是清楚的，也是可以调节控制的。
24.第六方面，本发明提供一种携带检测信号的核酸探针，其包括：
25.至少一个主核酸链、以及至少一个信号核酸链；其中，所述主核酸链为权利要求10所述的长单链核酸分子。
26.所述信号核酸链与所述主核酸链直接结合或间接结合，所述信号核酸链修饰有可被检测的信号标记物；
27.所述主核酸链的端部还具有用于与检测分子结合，所述检测分子可特异性结合靶标分子。
28.可选地，在一些实施例中，所述信号核酸链与所述主核酸链直接互补结合。
29.可选地，在一些实施例中，所述信号核酸链来自上述rca反应得到的长单链核酸分子。
30.可选地，在一些实施例中，所述信号核酸链通过至少一个支核酸链与所述主核酸链间接结合；
31.每个所述支核酸链包括：头部区和尾部区，所述头部区互补结合至所述主核酸链，所述尾部区互补结合至少一个所述信号核酸链。
32.可选地，在一些实施例中，所述信号核酸链通过至少一个第一支核酸链和至少一个第二支核酸链与所述主核酸链间接结合；
33.每个所述第一支核酸链包括：与所述主核酸链互补结合的第一头部区，以及互补结合至少一个所述第二支核酸链的第一尾部区；
34.每个所述第二支核酸链包括：与所述第一支核酸链的第一尾部区互补结合的第二头部区，以及互补结合至少一个所述信号核酸链的第二尾部区。
35.可选地，在一些实施例中，所述靶标结合区位于所述主核酸链的5’端。
36.可选地，在一些实施例中，所述信号标记物为量子点。需要说明的是，信号标记物也可以是其他标记物例如荧光蛋白，放射性同位素等。
37.可选地，在一些实施例中，所述量子点选自q525、q565、q585、q605、q625、655、q705和q800。
38.可选地，在一些实施例中，所述靶标分子为蛋白或多肽，所述检测分子为能特异性结合所述蛋白或所述多肽的抗体。
39.可选地，在一些实施例中，所述靶标分子为核酸片段，所述检测分子为能与所述核酸片段互补结合的核酸片段。
40.第七方面，本发明提供核酸探针结合物，所述核酸结合物包括检测分子、以及连接在所述检测分子上的上述核酸探针，所述检测分子可特异性结合靶标分子。
41.上述靶标分子可以是本领域任何感兴趣的多肽、蛋白或核酸片段等。相应地，所述检测分子可以能特异性结合所述蛋白或所述多肽的抗体，或是与所述核酸片段互补结合的核酸片段。
42.第八方面，本发明提供一种抗体-核酸探针结合物，所述抗体-核酸结合物包括抗体、以及连接在所述抗体上的如上所述的核酸探针，，所述核酸探针的端部连接至抗体。
43.第九方面，本发明提供一种单分子超灵敏度poct检测蛋白质的方法，其包括：使用如上所述的核酸探针，如上所述-核酸探针结合物，或如上所述的抗体-核酸探针结合物进行检测。
44.通过检测分子如抗体与目标蛋白的特异性结合，使得检测体系中的目标蛋白即靶标分子具有了可检测性，本领域技术人员通过对信号标记物的检测实现对目标蛋白的检测。
45.可选地，在一些实施例中，抗体的类别是根据目标蛋白的性质选择，只要能够结合或特异性结合至目标蛋白即可。例如其可以作为一抗，直接检测目标蛋白，也可以作为二抗，此时抗体是抗一抗的抗体，间接结合至目标蛋白实现检测。
附图说明
46.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
47.图1为利用mfold计算出不同环状模板c1与引物结合的结构与热力学参数；
48.图2实施例2中mss-rca信号放大方法与其他对照rca方法的反应流程图；
49.图3mss-rca与其他对照rca方法核酸环状模板的二级结构预测图；
50.图4为实施例2由连接酶反应生成的不同rca的dna环状模板page结果图；
51.图5为实施例2高灵敏精准定量纯化的核酸的荧光标准曲线图。
52.图6为实施例2中不同rca的扩增反应琼脂糖胶结果图。
53.图7为实施例3中不同rca的扩增反应的扩增效率对比图。
54.图8为实施例4中不同浓度的p1为引物的mss-rca(c1环状模板)与hybrid rca(c3环状模板)的扩增效率对比图。
55.图9为实施例4中直链型dna分子的afm图。
56.图10为实施例5-8中的核酸探针的结构示意图。
57.图11为实施例9中的抗体-核酸探针结合物结合目标蛋白分子的示意图。
58.附图10中的附图标记：
59.20-主核酸链，201-该靶标结合区，21-信号核酸链，211-荧光量子点，22-支核酸链，221-头部区，222-尾部区，23-第一支核酸链，231-第一头部区，232-第一尾部区，24-第二支核酸链，241-第二头部区，242-第二尾部区。
具体实施方式
60.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
61.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
62.实施例1
63.核酸序列的设计:本实施例设计了一端标记磷酸基团的仅含有三种碱基的具最少二级结构单链dna，使其能连接成环，得到环状核酸分子，其能进行快速高效的滚环扩增。
64.为了设计具最少二级结构的核酸环状模板。本实施例删除了一个碱基，最少二级结构的核酸环状模板受到连接酶的特性限制，考虑到单链核酸连接酶的连接活性与核酸长度有关，与核酸环状模板的5’端和3’端的碱基有关，还考虑到核酸环状模板的成本，此具最少二级结构的环状模板(mss-rca template)的长度一般设计为几十个碱基，5’端的碱基为g并修饰磷酸基团，3’端为t，序列为具最少二级结构的重复单元的整数倍。引物设计成与连接反应后形成的环状模板配对。其引物的序列设计的tm值考虑到适应扩增反应的温度。考虑到单链核酸酶在低于15个碱基就无法连接的特点和成本的问题，本实施例中的环状模板序列(c1)设计为总长度为50碱基的单链dna序列，此序列包含5个具最少二级结构的重复序列：(ggttattatt)5，线性核酸序列为：
65.ggttattattggttattattggttattattggttattattggttattatt(seq id no.1)；
66.前体结构：
67.本实施例中设计了5’带磷酸基团的具最少二级结构的单链dna(mss-rca-前体)，以及与其互补配对的引物primer 1；
68.作为对照组，ss-rca-前体含有四种碱基，包含5个具有二级结构的重复序列，以及与其补配对的引物primer 2。
69.作为过渡态的对照组，hybrid-rca-前体含有2个mss-rca-前体的重复序列，以及3个ss-rca-前体的重复序列。引物与环状模板配对的部分的长度设计均为20个碱基，tm值为52℃。
70.需要说明的是，上述引物的另外一端可设计成任何与需检测的目标配对的序列以
便后期设计成可检测靶标的生物传感器。
71.本实施例设计的前体核酸序列如下表1所示：
72.表1
[0073][0074]
图1为利用mfold计算出mss-rca的环状模板c1与引物p1、ss-rca的环状模板c2与引物p2、hybrid-rca的环状模板c3与引物p1、c3与引物p2结合的结构与热力学参数，结果显示tm值均高于60℃，能够在室温下完全互补配对。
[0075]
图2为nupack软件预测的各个单链环状模板形成的二级结构。结果显示，用于mss-rca的c1模板无二级结构产生，自由能为0kcal/mol,ss-rca的c2模板有二级结构产生，自由能为-9.96kcal/mol，hybrid-rca的c3模板比c2少的二级结构产生，自由能为-4.98kcal/mol。
[0076]
实施例2
[0077]
如图2所示，基于最少二级结构核酸环状模板滚环扩增技术的流程主要由环状模板的合成、环状模板的纯化、rca反应的步骤实现。
[0078]
图3显示了mss-rca与其他对照rca方法核酸环状模板的二级结构预测结果。
[0079]
每个步骤的具体过程如下:
[0080]
(1)环状模板的合成:连接反应体系为50μl，包含5μl 10x核酸单链连接酶缓冲液(ssdna/rna circligase buffer)、2.5μl50mm mncl2、1μl 1mm atp、10μl 100μm成环前体单链模板、2.5μl 100u/μl核酸单链连接酶(ssdna/rna circligase)。60℃孵育1小时，95℃孵育10分钟使核酸单链连接酶失活。此连接产物储存在-20℃储存。
[0081]
连接反应的产物结果用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(15％page胶)验证。结果如图4，从左至右的泳道分别为:20bp dna ladder、无核酸连接酶加入的mss-rca的单链c1模板、加入了核酸连接酶的mss-rca的c1模板、无核酸连接酶加入的ss-rca的单链c2模板、加入了核酸连接酶的ss-rca的c2模板、无核酸连接酶加入的hybrid-rca的单链c3模板、加入了核酸连接酶的hybrid-rca的c3模板。变性page电泳的结果表明，当连接反应没有加入核酸单链连接酶时，模板均只呈现一条带，是线状的状态。而在连接反应加入核酸单链连接酶成环后，在单链模板的上面均出现了新的条带，由于电泳中环状模板跑的比线状慢，因此可以确定此条带为连接成环的核酸环状模板。上述结果证明，经过单链核酸连接酶反应后体系中均已有环状核酸模板产物产生。
[0082]
(2)环状模板的纯化:配置15％page变性胶，样品中加入等体积的甲酰胺，95℃孵
育20分钟变性，加入样品体积的1/5的loading dye。100伏电压跑电泳，直到深蓝色的带跑出胶板。将2μl 10000x sybr greenⅰ加入到20ml水中配成1倍sybr greenⅰ终浓度的染液，将胶从胶板取下后，加入染液中孵育20-30分钟。取出胶后，放在发射蓝光的切胶仪上，小心将环状模板条带切除，收集在ep管中，称重。加入1-2倍体积的diffusion buffer(100mg胶加入100-150ml diffusion buffer),50℃600rpm振荡2小时，12,000rpm离心20分钟。取上清，加入3倍体积无水乙醇，-80℃放置1小时。4℃14,000rpm离心20分钟。弃上清。加入70％乙醇，4℃12,000rpm离心20分钟。弃上清。超净台干燥。加入适量的水溶解。用核酸纯化柱再次纯化dna。得到纯的核酸环状模板。
[0083]
由于一般nanodrop的检测灵敏度在ng/μl，通常本实施例的纯化方法得到的核酸环状模板的浓度通常在ng/μl水平，甚至低于ng/μl，因此用nanodrop无法对纯化的核酸环状模板无法精准定量。如果无法精准定量核酸环状模板便会影响后续的rca效率的比较与测定。因此在本实施例中，采用更高灵敏的sybr gold核酸染料对纯化的核酸环状模板进行高灵敏精准定量。定量标准曲线体系为50μl，体系中包含10μl不同浓度的单链状核酸模板，1μl 100x sybr gold。标准曲线结果如图5所示，结果显示，mss-rca的单链c1模板与sybr gold结合后，其荧光强度整体上最高，符合sybr gold结合单链时荧光强度高的特性3。也是验证了mss-rca的单链c1模板具有最少的二级结构。hybrid-rca的单链c3模板结合了sybr gold的荧光强度高于ss-rca的c2模板，证明了hybrid-rca的单链c3模板具有比ss-rca的c2模板更多的二级结构。结果还表明，这三个核酸模板在与sybr gold结合后的荧光信号均在0.25nm到256nm区间呈线性，能够对纯化的低浓度水平核酸环状模板进行高灵敏地精准定量。
[0084]
(3)rca反应:反应体系包含2μl 10x phi29 dna聚合酶缓冲液、1μl 10mm dntp、5u phi29 dna聚合酶、2μl 100nm纯化的核酸环状模板、不同浓度的引物。37℃反应(时间根据需求)，95℃孵育10分钟。
[0085]
环状模板c1与引物p1结合引发mss-rca反应、环状模板c2与引物p2结合引发ss-rca反应、环状模板c3与引物p1结合引发hybrid-rca-1反应、c3与引物p2结合引发hybrid-rca-2反应被实施验证rca反应的可行性。反应体系为20μl，37℃反应1小时，95℃孵育10分钟。在包含终浓度为20nm mss-rca的环状模板、终浓度为200nm的引物，rca反应的其余成分与实施例2中一致。结果显示，在10μlrca的dna产物中加入终浓度为2x sybr gold后，在蓝光照射下都有荧光信号产生，可以明显地看出环状模板c2与引物p2结合引发ss-rca反应发射的荧光信号最低(如图6所示)。
[0086]
上述结果可以说明：1、ss-rca反应产生了具有很多二级结构的dna产物因此导致结合sybr gold后荧光发光强度不高；2、且由于c2模板含有较多二级结构因此导致rca扩增产生的dna产物不够。
[0087]
上述步骤产生的扩增结果用0.6％琼脂糖凝胶电泳验证，用sybr gold点染法在蓝光照射琼脂糖凝胶结果。结果如图6所示。从左至右的泳道分别为:dna ladder、环状模板c1与引物p1结合引发mss-rca反应、环状模板c2与引物p2结合引发ss-rca反应、环状模板c3与引物p1结合引发hybrid-rca-1反应、c3与引物p2结合引发hybrid-rca-2反应。从琼脂糖电泳的结果表明，利用本实施例设计并合成的环状模板和各自对应的引物，上述rca反应1小时后均有长链dna产物产生。
[0088]
实施例3
[0089]
为了对比不同rca反应体系的扩增效率，环状模板c1与引物p1结合引发mss-rca反应、环状模板c2与引物p2结合引发ss-rca反应、环状模板c3与引物p1结合引发hybrid-rca-1反应、c3与引物p2结合引发hybrid-rca-2反应在同样体系中被实施并分别比较扩增效率。反应体系为80μl，37℃反应每隔5分钟取出5μl样品95℃孵育10分钟使phi29扩增酶失活停止扩增反应。反应包含20nm环状模板、终浓度为200nm的引物，rca反应的其余成分的浓度与实施例2中一致。
[0090]
结果显示(图7)，ss-rca反应扩增效率最慢，与引物p2结合的环状模板3引发的hybrid-rca-2扩增效率为其次，而mss-rca反应与引物p1结合环状模板c3引发hybrid-rca-1反应效率相当。这个结果进一步验证了上述实施例中ss-rca反应在扩增1小时后的荧光信号最低。不仅如此，与引物p2结合的环状模板3引发的hybrid-rca-2扩增效率比与引物p1结合环状模板c3引发hybrid-rca-1反应效率低，这一现象说明了，引物的二级结构阻碍了扩增反应，其原因可能是具有二级结构的引物的结合效率在室温下不如没有二级结构的引物结合效率高。而mss-rca反应与引物p1结合环状模板c3引发hybrid-rca-1反应效率相当的这一结果可能是反应由于引物浓度高，使得引物达到饱和。因此，后续实施例4改变了引物与环状模板的比例，具体研究比较了mss-rca与hybrid-rca-1反应效率。
[0091]
实施例4
[0092]
为了具体研究比较了mss-rca与hybrid-rca-1反应效率，环状模板c1与引物p1结合引发mss-rca反应、环状模板c3与引物p1结合引发hybrid-rca-1反应在同样体系中被实施并分别比较扩增效率。反应体系为80μl，37℃反应每隔5分钟取出5μl样品95℃孵育10分钟使phi29扩增酶失活停止扩增反应。反应包含10nm环状模板、终浓度为不同浓度的引物(2.5nm,5nm,10nm)，rca反应的其余成分的浓度与实施例2中一致。
[0093]
结果显示(图8)，在此实施例反应条件下，当增加引物的浓度，hybrid-rca-1的扩增效率也相应地提高，但是整体都低于mss-rca反应。而在mss-rca反应中，当增加引物的浓度，扩增效率仍然差不多，说明mss-rca扩增效率高，在此浓度范围内变化引物浓度不能影响其扩增效率。这个结果很好地证明了，mss-rca扩增效率最高，可以说明在相同条件，相同时间下，mss-rca能达到的灵敏度也高于其他含有二级结构的rca反应。上述实验结果证明已成功建立mss-rca 方法，此方法的扩增效率远远高于具有二级结构的环状模板的对照组。mss-rca 能合成长达至少6微米的直链型dna分子(见afm图，图9)。为以后在表面的mss-rca 扩增与分支信号放大，实现单分子检测提供基础，例如作为实施例5-9中的主核酸链，实施例5-9提供了得到的直链型dna分子的应用，具体见后文。
[0094]
实施例5
[0095]
本实施例提供一种携带荧光信号的核酸探针(如图10中的a0)，其包括一个主核酸链20以及一个信号核酸链21，信号核酸链21与主核酸链20直接结合，信号核酸链21修饰有荧光量子点211。
[0096]
该主核酸链20的端部(5’端)具有靶标结合区201，通过该靶标结合区201，该核酸探针可以目标分子(例如抗体)特异性结合，目标分子上修饰有与该靶标结合区201互补结合的结合核酸链。
[0097]
实施例6
[0098]
本实施例提供一种携带荧光信号的核酸探针(如图10中的a1，l1代表核苷酸长度，d1代表互补长度)，其结构与实施例5基本相同，不同的具有多个信号核酸链21，多个信号核酸链21独立地互补结合到主核酸链20上。相对于实施例5的携带了更多的荧光信号，荧光信号明显更强，也更容易被检测到。
[0099]
实施例7
[0100]
本实施例提供一种携带荧光信号的核酸探针(参考图10中a2)，其包括一个主核酸链20，多个信号核酸链21，以及多个支核酸链22。
[0101]
信号核酸链21修饰有荧光量子点211，信号核酸链21通过支核酸链22间接结合至主核酸链20。主核酸链20的端部(5’端)具有靶标结合区201。
[0102]
每个支核酸链22包括：头部区221和尾部区222，每个支核酸链22通过其头部区221互补结合至主核酸链20，每个支核酸链22的尾部区222互补结合有多个信号核酸链21。
[0103]
该结构的核酸探针荧光信号得到明显放大，更佳容易被检测到。
[0104]
实施例8
[0105]
本实施例提供一种携带荧光信号的核酸探针(参考图10中a3)，其包括一个主核酸链20，多个信号核酸链21，多个第一支核酸链23，以及多个第二支核酸链24；
[0106]
信号核酸链21修饰有荧光量子点，信号核酸链21通过第一支核酸链23和第二支核酸链24与主核酸链20间接结合。主核酸链20的端部(5’端)具有靶标结合区201。
[0107]
每个第一支核酸链23包括：与主核酸链20互补结合的第一头部区231，以及互补结合有多个第二支核酸链24的第一尾部区232；
[0108]
每个第二支核酸链24包括：与第一支核酸链23的第一尾部区232互补结合的第二头部区241，以及互补结合有多个信号核酸链21的第二尾部区242。
[0109]
该结构的核酸探针荧光信号得到更明显的放大，更容易被检测到。
[0110]
实施例5-8的核酸探针的放大倍数的计算公式见图10中公式，an表示荧光信号放大倍数；ln表示主核酸链或支核酸链尾部区的核苷酸长度；dn表示两核酸链间的互补配对的核苷酸长度；kn为每一级信号分支的常数。从图中可以看出，分支越多，荧光信号越强，也易于被检测。
[0111]
通过主核酸链和支核酸链的核苷酸长度ln，两个核酸链之间的互补配对部分的长度dn，则可以调节信号放大倍数。
[0112]
主核酸链可以是上述rca反应得到的单链dna，例如环状模板c1与引物p1的rca反应得到的单链dna；支核酸链和信号核酸链的序列也是容易获得的。
[0113]
实施例9
[0114]
本实施例提供一种抗体-核酸探针结合物，其结构如图11所示，其包括：抗体和结合在抗体上如实施例5-8任一种所述的荧光探针，将该抗体-核酸探针结合物与目标蛋白分子共同孵育，抗体-核酸探针结合物结合到目标蛋白分子，通过对荧光量子点的检测，即可实现对目标蛋白分子的检测。相关荧光检测手段为本领域公知的常规技术手段，本文不对此进行详细描述。
[0115]
综上，现有研究用体外筛选的方法发现了a和c含量高的dna序列作为rca反应的环状模板具有增加反应效率的特点，提出了dna环状模板的a和c的含量与扩增效率有关的理论。也有研究表明，rca扩增的效率不仅与环状模板的序列有关，而且与大小、二级结构和拓
扑结构有关。在上述实施例中，发明人认为rca的扩增效率主要与二级结构有关，并设计了一种缺失了一种碱基的具最少二级结构的dna环状模板进行rca反应。结果表明，以上述实施例提出的最少二级结构的dna序列为环状模板(c1)的rca扩增效率确实是高于其他含有二级结构的rca扩增方法，为生物传感、分子诊疗等领域依赖于rca信号放大的生物分析方法提供了新的更高效、更灵敏的信号放大核酸分子材料、新方法和研究工具。
[0116]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。