一种基于声学气泡阵列的体外快速三维肿瘤球类器官构建方法

1.本发明属于体外三维肿瘤模型的构建，特别涉及一种基于声学气泡阵列的体外快速三维肿瘤球类器官构建方法。


背景技术：

2.肿瘤球类器官是组织工程和生物研究中不可缺少的，特别是在观察药物的细胞毒性作用方面，为了重建体内条件和三维ecms，通常要求有球状的聚集形态和细胞间的紧密连接。基于二维细胞培养板的技术在观察重要的细胞-细胞连接、通信、空间分布和复杂的环境遇到了挑战。目前已有很多基于微流控技术方法来构建三维肿瘤类器官，如微孔或液滴细胞培养方法。这些方法通常将细胞播种或封装在一个封闭的空间内，允许介质或废物交换，从而通过自我组装来培养形成肿瘤球状体。被动细胞组装因其应用方便、成本低而被广泛使用，但其模型尺寸一致性差，且过程耗时长有待解决。主动的技术声学由于具有生物相容性、灵活性和柔性等优点，在生物和肿瘤相关研究和应用中引起了广泛的兴趣。当衰减或振荡发生时，在液体和固体的界面之间，或气泡和液体之间，发现了声流，产生二次声辐射力对细胞旋转聚集成紧密球体，快速构建体外三维肿瘤球类器官。


技术实现要素：

3.针对背景技术存在的问题，本发明提供一种基于声学气泡阵列的体外快速三维肿瘤球类器官构建方法。
4.为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
5.一种基于声学气泡阵列的体外快速三维肿瘤球类器官构建方法，包括如下步骤：
6.a)：制备pdms芯片，并粘合到玻璃基板上备用；
7.b)：将培养的细胞浓缩重悬到gelma水凝胶溶液中；
8.c)：将步骤b获得的细胞溶液注入到pdms芯片中，形成球状气泡阵列，在声学信号作用下细胞旋转聚集成球并附着在球状气泡上，在紫外光源辐照下成胶，快速构建出体外三维肿瘤球类器官。
9.优选地，pdms芯片具有侧腔阵列，侧腔与主沟道的角度为23
°
。
10.优选地，pdms中注入液体，侧腔会截留空气。
11.优选地，步骤b中培养的细胞是乳腺癌细胞。
12.优选地，水凝胶溶液中的gelma含量为5wt％-10wt％。
13.优选地，步骤b中细胞浓缩后的浓度为6
×
106个/ml。
14.优选地，步骤c中声学信号由压电陶瓷片产生，频率为28-36khz，施加的电压为12.6vpp。
15.优选地，步骤c中气泡阵列包括6行，每行七个独立的单元，总共42个单元。
16.优选地，声学信号引起球状气泡的一阶振荡，球状气泡的一阶振荡引起流体的二
阶振荡，产生二次声辐射力，步骤c中细胞受二次声辐射力作用，15秒内旋转聚集成紧密的球体，球体直径为30-300μm。
17.优选地，步骤c中紫外光辐照时间为15-60s，细胞球体封装在水凝胶里，水凝胶模拟肿瘤微环境。
18.本发明的优点在于：
19.1.以主动的方式可以快速的构建三维肿瘤球类器官。
20.2.构建的肿瘤球细胞间联系紧密。
21.3.声学的方法具有生物相容性，不会损伤细胞。
22.4.水凝胶可以模拟肿瘤微环境。
23.5.操作简单，成本低。
附图说明
24.图1为微流控芯片和压电陶瓷片图像；
25.图2为本发明细胞聚集到气泡上成球的明场图像；
26.图3为本发明气泡阵列图像；
27.图4为本发明细胞尺寸随时间变化图像；
28.图5为本发明封装在水凝胶中的肿瘤球体荧光图像；
具体实施方式
29.本实施例基于声学气泡阵列的体外三维肿瘤球类器官构建，包括以下步骤：
30.a：.利用光刻蚀技术制作su-8聚合物模板，设计的模板具有侧腔阵列，侧腔1与主沟道2的角度为23
°
，见附图2。将液体的pdms(体积比10:1)倾倒在su-8模板上，加热固化后剥离出pdms芯片。将pdms芯片和压电陶瓷片粘合到玻璃基板上备用如图1；
31.b：称取一定量的gelma样品溶解在光引发剂溶液中配成10％(w/v)水凝胶溶液，光引发剂用高糖培养基dmem溶解。将培养的细胞消化离心后重新均匀分散在水凝胶溶液中，使细胞的浓度为6
×
106个/ml；
32.c：将细胞溶液注入到微流控芯片中，侧腔会截留空气，形成球状气泡阵列如附图2，打开声学信号设置频率为32khz，施加的电压为12.6vpp。声力引起球状气泡的一阶振荡，球状气泡的一阶振荡引起流体的二阶振荡，产生二次声辐射力，二次声辐射力使细胞旋转聚集成球，并附着在球状气泡上，见附图3。随着时间的推移，球状气泡上的细胞球体聚集的越来越多，见附图4。选择紫外光进行辐照，在15-60s时间内成胶，细胞球体封装在水凝胶里，构建了体外三维肿瘤类器官，见附图5。
33.综上，本发明利用微流控芯片产生气泡阵列，具有成本低操作方便等优点。采用声学的方法来构建体外三维肿瘤类器官，具有生物相容性，且在15秒内形成球体，可见是非常的快速。形成的肿瘤球体细胞间联系紧密，且周围封装水凝胶模拟肿瘤微环境，总共形成了42个大小均匀的肿瘤球体。
34.应当理解的是，本说明书未详细阐述的部分均属于现有技术。
35.上述针对较佳实施例的描述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明权利要求所保护的
范围情况下，还可以做出替换或变形，均落入本发明的保护范围之内，本发明的请求保护范围应以所附权利要求为准。


技术特征：
1.一种基于声学气泡阵列的体外快速三维肿瘤球类器官构建方法，其特征在于，包括如下步骤：a)：制备pdms芯片，并粘合到玻璃基板上备用；b)：将培养的细胞浓缩重悬到gelma水凝胶溶液中；c)：将步骤b获得的细胞溶液注入到pdms芯片中，形成球状气泡阵列，在声学信号作用下细胞旋转聚集成球并附着在球状气泡上，在紫外光源辐照下成胶，快速构建出体外三维肿瘤球类器官。2.根据权利要求1所述基于声学气泡阵列的体外快速三维肿瘤球类器官构建方法，其特征在于，pdms芯片具有侧腔阵列，侧腔与主沟道的角度为23
°
。3.根据权利要求2所述基于声学气泡阵列的体外快速三维肿瘤球类器官构建方法，其特征在于，pdms中注入液体，侧腔会截留空气。4.根据权利要求1所述基于声学气泡阵列的体外快速三维肿瘤球类器官构建方法，其特征在于，步骤b中培养的细胞是乳腺癌细胞。5.根据权利要求1所述基于声学气泡阵列的体外快速三维肿瘤球类器官构建方法，其特征在于，水凝胶溶液中的gelma含量为5wt％-10wt％。6.根据权利要求1所述基于声学气泡阵列的体外快速三维肿瘤球类器官构建方法，其特征在于，步骤b中细胞浓缩后的浓度为6
×
106个/ml。7.根据权利要求1所述基于声学气泡阵列的体外快速三维肿瘤球类器官构建方法，其特征在于，步骤c中声学信号由压电陶瓷片产生，频率为28-36khz，施加的电压为12.6vpp。8.根据权利要求1所述基于声学气泡阵列的体外快速三维肿瘤球类器官构建方法，其特征在于，步骤c中气泡阵列包括6行，每行七个独立的单元，总共42个单元。9.根据权利要求1所述基于声学气泡阵列的体外快速三维肿瘤球类器官构建方法，其特征在于，声学信号引起球状气泡的一阶振荡，球状气泡的一阶振荡引起流体的二阶振荡，产生二次声辐射力，步骤c中细胞受二次声辐射力作用，15秒内旋转聚集成紧密的球体，球体直径为30-300μm。10.根据权利要求1所述基于声学气泡阵列的体外快速三维肿瘤球类器官构建方法，其特征在于，步骤c中紫外光辐照时间为15-60s，细胞球体封装在水凝胶里，水凝胶模拟肿瘤微环境。

技术总结
本发明提供了一种基于声学气泡阵列的体外快速三维肿瘤球类器官构建方法，首先，制作带有侧腔阵列的微流控芯片，然后将细胞均匀分散在甲基丙烯酰化明胶GelMA溶液中，注入微流控芯片形成气泡阵列，在声学信号的作用下，细胞旋转聚集成肿瘤球。本发明以主动的方式可以快速的构建三维肿瘤球类器官，构建的肿瘤球细胞间联系紧密，声学的方法具有生物相容性，不会损伤细胞，水凝胶可以模拟肿瘤微环境，操作简单，成本低，可应用于临床药物发现和个性化治疗。治疗。治疗。


技术研发人员：杨奕 郑晶晶
受保护的技术使用者：武汉大学深圳研究院
技术研发日：2022.06.26
技术公布日：2022/10/11