一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌、菌剂及其应用的制作方法

本公开涉及微生物，具体提供一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌、菌剂及其应用。

背景技术：

1、柑橘溃疡病的表现主要为叶片针头大小的黄色油浸状斑点，大部分在叶片背面随后逐渐扩大为圆形，四周凸起，中间凹陷，形似火山口；在果实上症状与叶片类似，在树枝上的程度较轻，但是无论在何部位，最终都会削弱树势，严重会导致柑橘早期落叶、落花，树势衰退，果实产量减少，品质降低，影响种植户经济收入。

2、柑橘溃疡病是一种毁灭性的世界检疫性病害，现已在世界多个国家和地区发生，对柑橘产业造成了极大的经济损失。

3、柑橘溃疡病的发生是以老叶上病斑为传染源，当温度和空气湿度适宜时溢出，通过风雨、昆虫传播，经寄主的气孔和伤口感染柑橘幼嫩组织。因此，常规防治溃疡病的措施包括防治虫害、及时清园、剪除病枝病叶等方式，可以减轻或者预防溃疡病的发生和蔓延，该方法成本高，效果无保障。

4、柑橘溃疡病的药剂防治普遍采用铜制剂，其可降低累积在新叶上的菌源，并减轻后续的感染，但铜制剂的过量使用导致柑橘园红蜘蛛爆发，果实铜超标，食用易造成肝损伤，且防治效果越来越差。

5、微生物是生物防治的重要组成部分，某些微生物能够通过分泌抗生素等次级代谢产物直接抑制病原菌的生长；某些微生物也可以通过分泌铁载体与病原菌竞争铁离子，从而间接实现抑制病原菌的生长；某些微生物可以通过诱导植物产生系统抗性增强植物的抗病能力。

6、但是现有技术中的微生物菌剂，防治柑橘溃疡病的效果较差。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明提供一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌、菌剂及其应用，实现以下发明目的：

2、筛选一种防治柑橘溃疡病效果好的微生物，用于防治柑橘溃疡病，大田实验的防效达85%以上；同时可以提高柑橘果实的品质。

3、为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

4、一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌的分类命名为枯草芽孢杆菌 bacillus subtilis，保藏编号为cgmcc no.24778，保藏日期为2022年4月26日。

5、以下是对上述技术方案的进一步改进：

6、一种防治柑橘溃疡病的菌剂，所述菌剂为上述枯草芽孢杆菌的发酵液，所述菌剂中，枯草芽孢杆菌的菌含量为112×108 cfu/ml。

7、所述枯草芽孢杆菌的发酵液的制备方法包括菌株活化、种子液制备、发酵；所述发酵包括一级种子罐培养、二级种子罐培养、发酵罐培养。

8、所述菌株活化的方法为将枯草芽孢杆菌在lb固体培养基上进行三区划线，37℃培养24h，得到活化的菌株。

9、所述种子液制备的方法为从活化的菌株中挑取单菌落接种到150ml种子培养基中，在37℃、200转/min下，培养14h，得到种子液。

10、所述一级种子罐培养的方法为，按照体积比为10%的接种量，将种子液接入一级种子罐的种子培养基，控制温度为37℃，通风为0.8v/v.m，ph为7.5，转速为200转/min，培养时间为12h，得到一级种子培养物；所述二级种子罐培养的方法为，按照10%接种量，将一级种子培养物接种到二级种子罐的种子培养基中，控制温度为37℃、通风为0.8 v/v.m、ph为7.5、转速为100转/min、培养时间为12h，取样镜检菌体处于对数生长期，得到二级种子培养物；所述发酵罐培养，将二级种子培养物转至发酵罐中培养，控制温度为37℃， 0-6h的通风量为0.8v/v.m，6h后的通风量调至2v/v.m，ph为7.5，转速为100转/min，培养时间为32h。

11、所述种子培养基和发酵罐内的发酵培养基，以质量百分比计，均由以下成分组成：麦芽糊精3%，豆粕粉6.5%，葡萄糖0.3%，七水硫酸镁0.1%，碳酸钙0.2%，磷酸氢二钠0.05%，硫酸锰0.02%，消泡剂0.15%，去离子水补足100%。

12、所述菌剂用于预防和防治柑橘溃疡病。

13、将菌剂用清水稀释至0.5亿/ml，得到菌剂稀释液，每亩叶面喷施菌剂稀释液50l。

14、本发明筛选的菌株jq-k98，分类命名为枯草芽孢杆菌 bacillus subtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年4月26日，保藏编号为cgmcc no.24778。

15、与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：

16、1）本发明所述枯草芽孢杆菌jq-k98，对柑橘溃疡病病原菌的抑菌圈直径为2.27cm。

17、2）本发明所述枯草芽孢杆菌jq-k98，处理柑橘溃疡病离体叶片，第10天的发病率仅为6.25%，对照组的发病率为87.5%，本发明所述枯草芽孢杆菌jq-k98对柑橘溃疡病离体叶片的防治效果达92.86%。

18、3）现有的枯草芽孢杆菌对柑橘溃疡病的防治效果较差，本发明所述枯草芽孢杆菌jq-k98与现有的枯草芽孢杆菌相比，对于柑橘溃疡病具有更强的防治效果。

19、本发明所述枯草芽孢杆菌jq-k98，用于大田防治柑橘溃疡病，防效达87.84%；现有的枯草芽孢杆菌菌剂，用于大田防治柑橘溃疡病，防效仅为25.08%，铜制剂的防效为44.22%；可见，本发明的枯草芽孢杆菌相对于现有的枯草芽孢杆菌以及铜制剂，对柑橘溃疡病具有更高的防效，取得预料不到的技术效果。

20、4）本申请所述微生物菌剂用于防治柑橘溃疡病，可以解决现有铜制剂大量应用所带来的重金属超标问题，并且可以提高果实品质和产量，增加果农的收入。

21、本发明微生物菌剂喷施处理后的柑橘，单果重为170.6g，可溶性固形物含量为13.9wt%，还原糖含量为5.2wt%，固酸比为29.3，糖酸比为10.9，维生素c含量为26.6mg/100g。

技术特征：

1.一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌，分类命名为枯草芽孢杆菌bacillus subtilis，保藏编号为cgmcc no.24778，保藏日期为2022年4月26日。

2.一种防治柑橘溃疡病的菌剂，其特征在于：所述菌剂为权利要求1所述枯草芽孢杆菌的发酵液，所述菌剂中，枯草芽孢杆菌的菌含量为112×108 cfu/ml。

3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌的发酵液的制备方法包括菌株活化、种子液制备、发酵；所述发酵包括一级种子罐培养、二级种子罐培养、发酵罐培养。

4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于：所述菌株活化的方法为将枯草芽孢杆菌在lb固体培养基上进行三区划线，37℃培养24h，得到活化的菌株。

5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于：所述种子液制备的方法为从活化的菌株中挑取单菌落接种到150ml种子培养基中，在37℃、200转/min下，培养14h，得到种子液。

6.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于：所述一级种子罐培养的方法为，按照体积比为10%的接种量，将种子液接入一级种子罐的种子培养基，控制温度为37℃，通风为0.8v/v.m，ph为7.5，转速为200转/min，培养时间为12h，得到一级种子培养物；所述二级种子罐培养的方法为，按照10%接种量，将一级种子培养物接种到二级种子罐的种子培养基中，控制温度为37℃、通风为0.8 v/v.m、ph为7.5、转速为100转/min、培养时间为12h，取样镜检菌体处于对数生长期，得到二级种子培养物；所述发酵罐培养，将二级种子培养物转至发酵罐中培养，控制温度为37℃， 0-6h的通风量为0.8v/v.m，6h后的通风量调至2v/v.m，ph为7.5，转速为100转/min，培养时间为32h。

7.根据权利要求6所述的菌剂，其特征在于：所述种子培养基和发酵罐内的发酵培养基，以质量百分比计，均由以下成分组成：麦芽糊精3%，豆粕粉6.5%，葡萄糖0.3%，七水硫酸镁0.1%，碳酸钙0.2%，磷酸氢二钠0.05%，硫酸锰0.02%，消泡剂0.15%，去离子水补足100%。

8.权利要求2所述菌剂的应用，其特征在于：所述菌剂用于预防和防治柑橘溃疡病。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：将菌剂用清水稀释至0.5亿/ml，得到菌剂稀释液，每亩叶面喷施菌剂稀释液50l。

技术总结
本发明提供一种防治柑橘溃疡病的枯草芽孢杆菌、菌剂及其应用，属于微生物技术领域，所述枯草芽孢杆菌，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏编号为CGMCC No.24778，保藏日期为2022年4月26日；本申请枯草芽孢杆菌与其它枯草芽孢杆菌相比，对于柑橘溃疡病具有较强的防治效果，本发明所述枯草芽孢杆菌JQ‑K98处理接种溃疡病病原菌后柑橘离体叶片，溃疡病的发病率仅为6.25%，对柑橘离体叶片溃疡病的防治效果达92.86%；本发明所述枯草芽孢杆菌JQ‑K98，用于大田防治柑橘溃疡病，防效达87.84%。

技术研发人员：郭中信,李达,杜秉海,王茂超,郭婧,李超
受保护的技术使用者：山东京青农业科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13