一种H3亚型禽流感病毒检测试剂盒

本发明属于分子生物学诊断，涉及一种h3亚型禽流感病毒的荧光定量rt-pcr快速检测方法。

背景技术：

1、目前禽流感病毒分为16种血凝素(ha)和9种神经氨酸酶(na)亚型，在野生水禽中广泛流行。其中，h3 亚型流感病毒宿主范围广泛，除能感染自然宿主野生禽类或家养禽类外，也可感染猪、犬和马等多种哺乳动物。一般情况下，人不会感染禽流感，但是流感病毒不停变异，会偶有跨越种群的传播。早在1998年，h3n2 流感病毒就在北美的猪群中广泛流行，引起了严重的呼吸道疾病症状。这些h3n2流感病毒是新型重组病毒，包含来自人类谱系流感病毒的ha、na和pb1基因片段、禽流感病毒的pa和pb2基因片段和来自经典猪谱系的m、ns和np基因片段。此外也有报道显示在北美和亚洲禽源h3亚型流感病毒可感染犬类，并引起明显的呼吸道症状。这些数据均表明，h3亚型禽流感病毒逐渐获得了跨物种传播的能力，对哺乳动物(包括人类)构成了威胁。因此，加强对h3亚型禽流感病毒的监测非常重要。

2、传统的流感病毒诊断方法包括在鸡胚或mdck细胞中培养分离病毒或进行血凝试验，但这两种方法较为耗时且实验条件要求严格。与传统方法不同，实时定量聚合酶链反应检测技术是一种快速且高度灵敏的检测方法，并广泛应用于流感病毒的快速诊断。目前商用的流感病毒检测试剂盒主要用于检测甲型流感病毒基质基因的实时逆转录定量聚合酶链反应。本研究旨在开发一种快速、灵敏、有效的h3亚型禽流感病毒检测产品，这能促进更早更广泛的发现h3亚型禽流感病毒感染，有效控制疫情扩散。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种能快速、准确检测h3亚型禽流感病毒的荧光定量rt-pcr试剂盒(探针法)，具有特异性好、灵敏度高、准确性好、检测速度快、操作简便等特点。通过以下步骤和技术方案实现：

2、设计特异性引物与探针：根据h3血凝素基因保守区域设计了一组针对h3亚型禽流感病毒血凝素基因的检测引物与探针，包括两条引物和一条探针，序列分别是：

3、上游引物：h3-f：5’-cctttgccatatcatgctt-3’(seq id no.1)，

4、下游引物：h3-r：5’-aatgttgcayctratrttgc-3’(seq id no.2)；

5、探针：h3-p：5’-texas red-tgggcctgccag-mgb-3’(seq id no.3)，h3-p的5’端进行报告荧光染料texas red标记，3’端进行荧光淬灭基团mgb标记。

6、本发明还提供一种h3亚型禽流感病毒荧光定量rt-pcr检测试剂盒(探针法)，包括两条引物和一条探针，

7、所述引物为h3-f和h3-r，

8、h3-f的序列信息：5’-cctttgccatatcatgctt-3’(seq id no.1)，

9、h3-r的序列信息：5’-aatgttgcayctratrttgc-3’(seq id no.2)；

10、探针为h3-p，

11、h3-p的序列信息：5’-texas red-tgggcctgccag-mgb-3’(seq id no.3)。

12、所述的引物和探针浓度均为10微摩尔。

13、进一步的，还包括一步法荧光定量pcr反应缓冲液、一步法荧光定量pcr反应混合酶和无核酸酶水。

14、试剂盒包括一步法荧光定量pcr反应缓冲液12.5微升、一步法荧光定量pcr反应混合酶1.25微升、 10微摩尔的h1-f 1.5微升、10微摩尔的h1-r 1.5微升、10微摩尔的h1-p0.5微升、模板1微升、无核酸酶水6.75微升，总反应体系为25微升，其中模板可以为阳性对照、阴性对照或待检样本。试剂盒的荧光定量rt-pcr反应扩增条件：第一阶段，反转录：55摄氏度，15分钟；第二阶段，预变性：95摄氏度，30秒；第三阶段，pcr扩增：95摄氏度，5秒；60摄氏度，34秒，40个循环，每次循环第三阶段60摄氏度扩增后采集荧光信号，选择荧光通道cy5。

15、另外，本发明还提供了检测h1亚型禽流感病毒的荧光定量rt-pcr试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

16、1)利用核酸提取试剂从待测样本中提取rna。

17、2)利用检测试剂盒中提供的引物与探针、一步法荧光定量pcr反应缓冲液、一步法荧光定量pcr反应混合酶和无核酸酶水进行荧光定量rt-pcr反应，扩增核酸。

18、3)荧光定量rt-pcr反应扩增条件：第一阶段，反转录：55摄氏度，15分钟；第二阶段，预变性：95 摄氏度，30秒；第三阶段，pcr扩增：95摄氏度，5秒；60摄氏度，34秒，40个循环，每次循环第三阶段60摄氏度扩增后采集荧光信号，选择荧光通道cy5。

19、4)根据ct值判断荧光定量rt-pcr检测结果，判定样品中是否含有h3亚型禽流感病毒。

20、本发明的另一个目的是提供含检测h3亚型禽流感病毒的特异性引物和探针的特异性检测试剂盒用于快速鉴定h3亚型禽流感病毒的应用。在含有h3亚型禽流感病毒的体液、尿囊液或其他环境样本中的检测。

21、本发明公开了一种h1亚型禽流感病毒的荧光定量逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,rt-pcr)快速检测试剂盒(探针法)。该试剂盒包含了检测或辅助检测h1亚型禽流感病毒的荧光定量rt-pcr的成套特异性引物和探针，为上游引物h1-f、下游引物h1-r和探针h1-p。经实验证明，该荧光定量rt-pcr试剂盒对h3禽流感病毒具有良好的特异性、敏感性和重复性，为临床诊断、检验检疫等领域的流感疫情早期预警机制提供了可行的技术支持。本发明提供的试剂盒特异性强、灵敏度高、可靠性好、操作简便等优点，适用于大量禽类样本的筛选与鉴定。本发明可以特异性检测h1亚型禽流感病毒，与其他亚型禽流感病毒无交叉反应，为h1亚型禽流感病毒感染的诊断提供了有效的工具，并可推广应用于临床和实验研究。

22、说明书附图

23、图1为h3亚型禽流感病毒荧光定量rt-pcr检测试剂盒的特异性。

24、图2为h3亚型禽流感病毒荧光定量rt-pcr检测试剂盒的灵敏度。

技术特征：

1.一种检测h3亚型禽流感病毒的特异性引物和探针，其特征在于，

2.如权利要求1所述的检测h3亚型禽流感病毒的特异性引物和探针，其特征在于，h3-p的5’端进行报告荧光染料texas red标记，3’端进行荧光淬灭基团mgb标记。

3.一种h3亚型禽流感病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的特异性引物和探针。

4.如权利要求3所述的h3亚型禽流感病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3所述的特异性引物和探针，浓度均为10微摩尔。

5.如权利要求3所述的h3亚型禽流感病毒检测试剂盒，其特征在于，试剂盒包括一步法荧光定量pcr反应缓冲液12.5微升、一步法荧光定量pcr反应混合酶1.25微升、10微摩尔的h3-f 0.5微升、10微摩尔的h3-r 0.5微升、10微摩尔的h3-p 0.5微升、模板1微升、无核酸酶水8.75微升，总反应体系为25微升，其中模板可以为阳性对照、阴性对照或待检样本。

6.如权利要求5所述的检测h3亚型禽流感病毒的荧光定量rt-pcr试剂盒，其特征在于，试剂盒的荧光定量rt-pcr反应扩增条件：第一阶段，反转录：55摄氏度，15分钟；第二阶段，预变性：95摄氏度，30秒；第三阶段，pcr扩增：95摄氏度，5秒；60摄氏度，34秒，40个循环，每次循环第三阶段60摄氏度扩增后采集荧光信号，选择荧光通道texas red。

7.权利要求3-6所述的检测h3亚型禽流感病毒的荧光定量rt-pcr试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

8.权利要求3-6所述的检测h3亚型禽流感病毒的荧光定量rt-pcr试剂盒用于快速鉴定h3亚型禽流感病毒的应用。

9.如权利要求8所述的应用，所述试剂盒用于体液、尿囊液或其他环境样本中的检测。

技术总结
本发明公开一种H3亚型禽流感病毒检测试剂盒，所述试剂盒包括针对H3亚型禽流感病毒血凝素基因保守区域的特异性引物和探针、荧光定量逆转录‑聚合酶链式反应(Reverse Transcription‑Polymerase ChainReaction,RT‑PCR)预混液、荧光定量RT‑PCR反应酶和无核酸酶水。本发明提供的试剂盒通过一步法荧光定量RT‑PCR(探针法)快速检测H3亚型禽流感病毒，反应在一管内完成，操作方便，并降低了污染风险，实现H3亚型禽流感病毒的快速检测。本发明提供的试剂盒具有特异性强、稳定性好、准确率高等优点，为H3亚型禽流感病毒感染的诊断提供了有效的工具，并可推广应用于临床和实验研究。

技术研发人员：吴海波,杨帆,颜思静,姚航平,吴南屏
受保护的技术使用者：浙江大学医学院附属第一医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13