一种检测沙门菌的靶基因、PCR引物对、检测方法和用途

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种检测沙门菌的靶基因、pcr引物对、检测方法和用途。

背景技术：

1、沙门菌(salmonella)是一种重要的人兽共患病原菌，在全球范围内广泛分布。根据kauffman-white提出的血清型分类，沙门菌可分为a、b、c1、c2、d、e1～e4、f、g、i等血清群，这些血清群进一步细分成血清型，目前已发现2600多种血清型。

2、在过去几十年中由其引发的食物中毒事件屡屡发生，造成了严重的公共卫生问题。根据食品和饲料快速警报系统(rasff)的报告，沙门菌的发病率从2006年到2020年一直在逐年增长。引起人类感染的常见沙门菌主要有肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、圣保罗沙门菌、海德堡沙门菌、纽波特沙门菌、德尔卑沙门菌等多种血清型沙门菌。还有一些血清型虽不常见，却有更强的致病性，如猪霍乱沙门菌、都柏林沙门菌等亦能引起严重疾病。因此，对沙门菌采取可靠、高效的检测手段尤为重要。

3、目前，鉴定传统沙门菌所使用的主要技术依然是传统微生物培养法，该方法需要预增菌、选择性增菌、分离纯化等一系列预处理，耗时一般长达1周左右，难以满足快速检测的需求。因此需要研究出更快，更简便的方法。国际标准化组织(iso)在过去的几年内使pcr标准化并用于食品检测。pcr可以在短时间内产生更多的数据，数据的可信度更高，降低工作量，因此分析的花费也低。沙门菌的外膜蛋白(omp)存在于多数血清型中，常具有较高的相似性，是一类可对多种沙门菌血清型进行广谱检测的靶标。但现有技术中靶标存在特异性不强，检测灵敏度低的问题。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种检测沙门菌的靶基因、pcr引物对、检测方法和用途，以期解决现有技术中存在的问题。

2、发明人发现pagn基因存在于沙门菌绝大多数血清型中，而非沙门菌中pagn基因的相似性为0，非沙门菌中不存在pagn基因。根据pagn基因的分布特点可将沙门菌与非沙门菌区分开。在此基础上发明人设计了相关的检测试剂盒。

3、为实现上述目的，本发明具体采用如下技术方案。

4、本发明的第一方面保护，pagn基因作为靶标在制备和/或筛选检测沙门菌产品中的用途，所述pagn基因的核苷酸序列包括如seq id no.3所示序列。

5、本发明的第二方面保护，检测pagn基因的物质在制备和/或筛选检测沙门菌产品中的用途。

6、根据本申请的某些实施方式，所述检测pagn基因的物质包括pcr引物对，所述pcr引物对的序列包括如seq id no.1所示序列和如seq id no.2所示序列。

7、本发明的第三方面保护，一种用于快速检测沙门菌的引物对，所述pcr引物对的序列包括如seq id no.1所示序列和如seq id no.2所示序列。

8、本发明的第四方面保护，一种快速检测沙门菌的pcr检测试剂盒，所述试剂盒中包括检测pagn基因的物质。

9、根据本申请的某些实施方式，所述检测pagn基因的物质包括pcr引物对，所述pcr引物对的序列包括如seq id no.1所示序列和如seq id no.2所示序列。

10、根据本申请的某些实施方式，所述pcr检测试剂盒试剂盒还含有无菌水、taq dna聚合酶、样品基因组dna提取试剂中的一种或多种。

11、由于此类pcr常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。

12、根据本申请的某些实施方式，所述pcr检测试剂盒，可以是含有独立包装的引物对，也可以是含有配置好的含有引物对的pcr检测液。

13、根据本申请的某些实施方式，所述pcr检测液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用pcr检测液加入引物获得。例如，所述试剂盒中还可以含有无菌水(ddh2o)、2×taq master mix。加入本发明的引物、待检样本dna提取物或者样本菌液即可获得pcr反应体系。

14、根据本申请的某些实施方式，所述pcr检测试剂盒中还可含有阳性对照。所述阳性对照为含有pagn基因表达的dna样本。

15、根据本申请的某些实施方式，所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为无pagn基因表达的dna样本。

16、本发明的第五方面保护，一种快速检测沙门菌的方法，包括如下步骤：

17、(1)提取样品基因组dna；

18、(2)所述样品基因组dna与pcr反应体系进行pcr反应，所述pcr反应体系含有检测pagn基因的物质；优选地，所述检测pagn基因的物质包括pcr引物对，所述pcr引物对的序列包括如seq id no.1所示序列和如seq id no.2所示序列；

19、(3)pcr反应结束后，分析结果。

20、根据本申请的某些实施方式，以pcr反应体系的总体积为基准计，所述检测pagn基因的物质的浓度为40～60nm。在某些优选的实施方式中，为50nm。

21、根据本申请的某些实施方式，所述分析结果包括进行凝胶电泳检测pcr反应产物，然后比较电泳后条带，如果在554bp位置有条带，则证明所述样品中含有沙门菌。

22、根据本申请的某些实施方式，所述pcr反应的条件设置为：(a)95℃预变性5min；(b)95℃变性30s；(c)58℃退火30s；(d)72℃延伸1min，(b)～(d)循环25次，(e)72℃5min；(f)4℃保存。

23、本发明的第五方面保护，如上文所述的引物对或如上文所述的pcr检测试剂盒在检测沙门菌中的用途。

24、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

25、1)本发明发现pagn是一个8次跨膜的外膜蛋白，由位于染色体的pagn基因编码，存在于绝大多数沙门菌血清型中，在非沙门菌中不存在pagn基因，其能作为不同血清型沙门菌pcr检测的靶标。

26、2)以本发明的pcr为引物对制成的pcr检测试剂盒，能适用于不同血清型沙门菌的检测，具有沙门菌属特异性。本发明的试剂盒能快速高通量检测不同血清型沙门菌，可作为沙门菌属鉴定的辅助方法，并为沙门菌的监测与实验室诊断提供了一种简单快速、特异性好、灵敏度高且重复性好的新方法。

27、3)相比与常用的stn pcr，以发明的pcr引物对对样本进行检测时，检测敏感性更高。

28、4)相比与传统微生物培养法，以发明的pcr引物对对样本进行检测时，时间更短、更简便。

技术特征：

1.pagn基因作为靶标在制备和/或筛选检测沙门菌产品中的用途，所述pagn基因的核苷酸序列包括如seq id no.3所示序列。

2.检测pagn基因的物质在制备和/或筛选检测沙门菌产品中的用途。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述检测pagn基因的物质包括pcr引物对，所述pcr引物对的序列包括如seq id no.1所示序列和如seq id no.2所示序列。

4.一种用于快速检测沙门菌的pcr引物对，其特征在于，所述pcr引物对的序列包括如seq id no.1所示序列和如seq id no.2所示序列。

5.一种快速检测沙门菌的pcr检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括检测pagn基因的物质。

6.如权利要求5所述的pcr检测试剂盒，其特征在于，所述检测pagn基因的物质包括pcr引物对，所述pcr引物对的序列包括如seq id no.1所示序列和如seq id no.2所示序列。

7.如权利要求5所述的pcr检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有无菌水、taqdna聚合酶、样品基因组dna提取试剂中的一种或多种。

8.一种快速检测沙门菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述分析结果包括进行凝胶电泳检测pcr反应产物，然后比较电泳后条带，如果在554bp位置有条带，则证明所述样品中含有沙门菌。

10.如权利要求4所述的pcr引物对或如权利要求5～7任一项所述的pcr检测试剂盒在检测沙门菌中的用途。

技术总结
本发明公开了一种检测沙门菌的靶基因、PCR引物对、检测方法和用途。PagN基因作为靶标在制备和/或筛选检测沙门菌产品中的用途，所述PagN基因的核苷酸序列包括如SEQID NO.3所示序列。本发明的PagN基因在沙门菌中出现，而不在其他微生物中存在，PagN基因作为不同血清型沙门菌PCR检测的靶标，本发明还提供了PCR引物对，能同时识别不同血清型沙门菌，特异性高、灵敏度高和准确率高，对识别沙门菌的暴发流行，相关疾病的诊断和控制具有重要意义。

技术研发人员：焦新安,孟闯,丁睿清,潘志明,尚月月,徐双媛,刘钧,康喜龙,顾丹
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11