一种改善宠物犬猫排便功能的低聚肽制备方法与流程

1.本发明涉及活性肽制备领域，具体地说，本发明涉及一种改善宠物犬猫排便功能的低聚肽制备方法。


背景技术：

2.小麦谷朊粉含有75％～85％的蛋白质，5％～7％左右淀粉。小麦蛋白主要由麦醇溶蛋白和麦谷蛋白组成，富含半胱氨酸，其中半胱氨酸含量大约占总氨基酸含量的2.0％～2.5％，高于常见的植物蛋白，而这些半胱氨酸的巯基以分子内和分子间二硫键形式存在，故造成其溶解性差和生物利用率低等问题。
3.随着蛋白质营养学研究的深入，研究者发现动物对蛋白质的吸收并非单纯以游离氨基酸形式吸收，还能以低聚肽形式吸收，后者还具有吸收速度快，不易饱和、可促进氨基酸吸收等优点，因此越来越多的蛋白质被水解成多肽来利用。用蛋白酶酶解小麦谷朊粉不仅可以增加其溶解性，还可以获得具有降血压、抗氧化和提高免疫力等多种生物活性的小麦肽，其中含半胱氨酸的多肽还具有广谱抗菌、鳌合金属离子等作用，还可以作为半胱氨酸缓释前体物质在体内发挥重要的生理作用：(1)直接脱去巯基和氨基，生成丙酮酸，参与糖代谢；(2)巯基氧化成亚磺基，然后脱去氨基和亚磺基，最后生成丙酮酸和亚硫酸，前者能参与糖代谢，后者经氧化后可变为硫酸；(3)巯基氧化成亚磺基后，经脱羧形成亚牛磺酸，亚牛磺酸是良好的抗氧化剂，可被氧化生成牛磺酸，牛磺酸是调节机体正常生理活动的活性物质，具有消炎、镇痛、维持机体渗透压平衡、维持正常视觉等功能，也是胆汁酸的组成成分，形成的胆汁酸盐有助于促进脂类的消化吸收；(4)半胱氨酸也是合成谷氨酸的原料，进而合成谷胱甘肽，能帮助犬猫保持正常的免疫系统功能，并具有抗氧化作用、解毒作用。
4.蛋白质的二硫键数目越多，蛋白质分子对抗外界因素影响的稳定性就愈大，蛋白酶很难接触到二硫键保护的酶解位点，表现为抗蛋白酶消化的能力比较强，故利用常规方法酶解小麦谷朊粉在较低的水解度下(≤8％)，低聚肽的半胱氨酸含量低(≤0.25％)，在较高的水解度下(≥15％)，可提高低聚肽中半胱氨酸含量(≥1％)，但因为过度水解会导致多肽活性损失和水解物中的游离氨基酸含量偏高(≥25％)。孙媛等(孙媛,孔祥珍,华欲飞.小麦面筋蛋白含半胱氨酸小麦肽的富集与表征[j].食品与发酵工业,2020,46(19):64-69.)利用巯丙基树脂sepharose 6b对含半胱氨酸小麦肽进行富集，巯基含量由原来的195μmol/g蛋白上升至994.95μmol/g蛋白，但是该方法工艺复杂、成本高，目前能直接在较低的水解度条件下获得半胱氨酸含量高的小麦低聚肽的工艺尚未见到报道。
[0005]
便软拉稀是一种经常发生在宠物犬猫身上的症状，其不仅会影响宠物犬猫的正常生理活动，对宠物的健康状态也造成较大的损害，更严重影响了宠物与人类间的交往互动。造成宠物犬猫便软拉稀的原因可分为病理性与非病理性。病理性便软拉稀通常是因为宠物感染了某些致病菌，引起肠道的炎症或者肠道正常微生物种群变化，从而影响了肠道对粪便水分等营养物质的吸收，造成便软拉稀的情况；而非病理性便软拉稀70％～80％是由于宠物犬猫在换粮或生活环境突然改变造成的应激状态，影响其消化道状况或者肠道菌群等
微环境，对营养物质吸收能力变差，从而导致粪便水分等营养物质含量变高。目前，市面上存在许多针对宠物犬猫病理性便软拉稀的产品，但利用小麦低聚肽缓解或者改善宠物犬猫因应激造成的拉稀便软的研究尚未见到报道。


技术实现要素：

[0006]
为克服已有方法存在的缺陷，本发明的目的一方面是提供一种含高半胱氨酸及其氧化物的小麦低聚肽的制备方法，另一方面是提供其在宠物功能食品中的应用方法。
[0007]
本发明提供一种改善宠物犬猫排便功能的低聚肽制备方法，按照如下步骤进行：
[0008]
(1)小麦谷朊粉预水解
[0009]
将10份小麦谷朊粉加入125～200份水中，加入0.05～0.1份中性蛋白酶，维持ph为5.5～7.0，维持温度为50～60℃，酶解一段时间至水解度为3％～5％。
[0010]
通过本设定，小麦谷朊粉经过蛋白酶预水解分子量变小，可以形成粘附性较低的悬浮液，可以克服小麦谷朊粉在水中搅拌易吸附粘结成团的缺点，有利于后续反应。
[0011]
(2)小麦谷朊粉的半胱氨酸氧化
[0012]
将预水解的小麦谷朊粉ph调节为5.5～7.0，加入0.005～0.01份淀粉酶(糖化酶)，0.005～0.01份葡萄糖氧化酶，恒定温度40～50℃，泵入空气，施加发散式超声处理(超声功率密度10～50w/l，超声频率40～60khz)并搅拌15～20min。
[0013]
通过本设定，将小麦谷朊粉中的淀粉水解成葡萄糖，利用葡萄糖氧化酶催化葡萄糖和溶于酶解液的氧气反应生成葡萄糖酸-δ-内酯和h2o2，利用超声波的空化作用产生的瞬时高温辅助h2o2氧化半胱氨酸的游离巯基和二硫键，使得蛋白质局部紧密结构打开，有利于后续的蛋白酶解。
[0014]
(3)氧化处理的小麦谷朊粉的酶解
[0015]
经预处理的小麦谷朊粉不补加蛋白酶或者补加0.02～0.05份中性蛋白酶，维持ph为5.5～7.0和温度为50～60℃，继续酶解一段时间至水解度为10％～12％，反应结束经煮沸15～20min灭酶，离心取上清，喷雾干燥制得小麦低聚肽。
[0016]
上述的中性蛋白酶能耐受h2o2氧化，酶活损失小，故可以不补加中性蛋白酶继续反应。
[0017]
2、将上述方法获得的小麦低聚肽在改善宠物犬猫的非病理性拉稀、便软等亚健康状况的宠物食品中应用。
[0018]
本发明具体的优点：
[0019]
(1)本发明中小麦谷朊粉经蛋白酶预水解克服其在水中搅拌易粘附成团的缺点，对于后续的h2o2氧化半胱氨酸的二硫键打开蛋白质牢固的二硫键结构，在低水解度制备高半胱氨酸(及其衍生物)的小麦低聚肽是非常有利的。与传统工艺相比，本方法制备的产品半胱氨酸含量高(》1.1％)，低聚肽水解程度低(《12％)，游离氨基酸少(《10％)，没有过度酶解，苦味低适口性好，产品中含有的葡萄糖酸-δ-内酯还能起到稳定剂、酸味剂、保鲜剂和防腐剂的作用；
[0020]
(2)本发明制备的小麦低聚肽富含半胱氨酸除可供身体补充营养外，还可以进一步转化为牛磺酸参与身体代谢，具有消炎、镇痛、维持机体渗透压平衡、维持正常视觉功能、促进脂类的消化吸收等作用，另外还有比较高比例的谷氨酰胺(20％左右)，对胃肠黏膜上
皮成分己糖胺和葡萄糖胺的生化合成有促进作用，能够发挥其保护肠道粘膜、促进肠道吸收能力。
[0021]
(3)动物试验证明本发明制备的小麦低聚肽可以有效改善宠物犬猫的肠胃情况，减少宠物犬猫因为饲养地或日粮改变造成的非病理性拉稀、软便等问题，犬排便正常率从30％增加到90％以上，猫排便正常率从20％增加到70％以上，增强宠物犬猫对新环境、新粮的适应能力，为宠物主人饲养犬猫提供便利。
具体实施方式
[0022]
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0023]
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
[0024]
游离氨基酸测定方法：称取含蛋白10～20mg的样品(约50～100mg，准确至0.1mg，称样量与稀释倍数配合，使最终每种氨基酸浓度在50～200nmol/ml，或总氨基酸质量浓度在0.1～0.3mg/ml)于20ml厌氧管中。加入10ml的6mol/l hcl(取500ml优级纯盐酸(36％～38％)，定容到1000ml，加1g苯酚)。再将水解管放入冷冻剂中，冷冻3～5min，再接到真空泵的抽气管上，抽真空(接近0pa)，然后充入高纯氮气；再抽真空充氮气，重复三次后，在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖。将已封口的水解管放在110℃
±
1℃的恒温烘箱内，水解22h后取出冷却。水解完成后，冷却、混匀、开管、过滤(滤纸)、定容。取适量(0.2ml左右)滤液置于1.5ml离心管中，于浓缩仪中，低于60℃，抽真空，蒸发至干，必要时加少许水，重复蒸干1～2次。加入上样液后上机测定。
[0025]
半胱氨酸测定方法：取含蛋白7.5～25mg的样品于20ml厌氧管中(切勿粘壁)；置于0℃冰水中加入2ml预冷的过甲酸溶液(30％h2o2和88％甲酸按照1：9(v/v)混合，于室温下放置1h，置于0℃冰水中冷却30min，临用前配置)，加液时需将样品全部润湿，但不能摇动；在2℃的冰箱中放置15h，或者55℃水浴中放置15min；溶液中多余的过甲酸可以通过加入偏重亚硫酸钠168mg，在冰浴静置30min；加入7.5ml hcl(6.8mol/l)；置于110
±
1℃恒温烘箱中水解22～24h。水解完成后，冷却，混匀，用超纯水把水解液转移到50ml容量瓶，加入适量氢氧化钠溶液调节ph至2.2，再定容，震荡混匀，取适量样品用0.22μm滤膜过滤后，供上机测定使用。
[0026]
谷氨酰胺测定方法：参考陶冠军等(郑州粮食学院学报,1999,20(4):65-67)的方法。
[0027]
本发明中使用的中性蛋白酶(单位酶活为10万u/g)、淀粉酶(糖化酶，单位酶活为10万u/g)、葡萄糖氧化酶(单位酶活为1万u/g)购于南宁庞博生物工程有限公司。
[0028]
对比例1
[0029]
将10份小麦谷朊粉加入200份水中，加入0.05份中性蛋白酶，维持ph为6.5和温度为50℃，酶解一段时间至水解度为8％，反应结束经煮沸15min灭酶，离心取上清，喷雾干燥制得小麦低聚肽，所得多肽半胱氨酸含量为0.25％，游离氨基酸含量为15％，谷氨酰胺含量
为18％。
[0030]
对比例2
[0031]
将10份小麦谷朊粉加入200份水中，加入0.05份中性蛋白酶，维持ph为6.5和温度为50℃，酶解一段时间至水解度为18％，反应结束经煮沸15min灭酶，离心取上清，喷雾干燥制得小麦低聚肽，所得多肽半胱氨酸含量为0.86％，游离氨基酸含量为28.0％，谷氨酰胺含量为20.2％。
[0032]
实施例1
[0033]
将10份小麦谷朊粉加入200份水中，加入0.05份中性蛋白酶，维持ph为6.5和温度为50℃，酶解一段时间至水解度为3％。
[0034]
将预水解的小麦谷朊粉ph调节为5.5，加入0.005份淀粉酶(糖化酶)，0.01份葡萄糖氧化酶，恒定温度50℃，泵入空气，施加发散式超声处理(10w/l，60khz)并搅拌20min。
[0035]
经预处理的小麦谷朊粉补加0.05份中性蛋白酶，维持ph为6.5和温度为50℃，酶解一段时间至水解度为10％，反应结束经煮沸15min灭酶，离心取上清，喷雾干燥制得小麦低聚肽。所得小麦低聚肽的半胱氨酸含量为1.13％，游离氨基酸含量为9.2％，谷氨酰胺含量为18.2％。
[0036]
实施例2
[0037]
将10份小麦谷朊粉加入125份水中，加入0.1份中性蛋白酶，维持ph为7.0，维持温度为60℃，酶解一段时间至水解度为5％。
[0038]
将预水解的小麦谷朊粉ph调节为6.5，加入0.01份淀粉酶(糖化酶)，0.01份葡萄糖氧化酶，恒定温度40℃，泵入空气，施加发散式超声处理(50w/l，40khz)并搅拌15min。
[0039]
经预处理的小麦谷朊粉不补加蛋白酶，维持ph为7.0和温度为60℃，酶解一段时间至水解度为12％，反应结束经煮沸20min灭酶，离心取上清，喷雾干燥制得小麦低聚肽。所得小麦低聚肽的半胱氨酸含量为1.78％，游离氨基酸含量为5.3％，谷氨酰胺含量为21.5％。
[0040]
实施例3
[0041]
将10份小麦谷朊粉加入200份水中，加入0.075份中性蛋白酶，维持ph为5.5，维持温度为55℃，酶解一段时间至水解度为4％。
[0042]
将预水解的小麦谷朊粉ph调节为6.5，加入0.0075份淀粉酶(糖化酶)，0.0075份葡萄糖氧化酶，恒定温度45℃，泵入空气，施加发散式超声处理(30w/l，50khz)并搅拌15min。
[0043]
经预处理的小麦谷朊粉不补加蛋白酶，维持ph为5.5和温度为55℃，酶解一段时间至水解度为10％，反应结束经煮沸20min灭酶，离心取上清，喷雾干燥制得小麦低聚肽。所得小麦低聚肽的半胱氨酸含量为1.23％，游离氨基酸含量为8.71％，谷氨酰胺含量为19.6％。
[0044]
实施例4
[0045]
将10份小麦谷朊粉加入125份水中，加入0.08份中性蛋白酶，维持ph为6.5，维持温度为60℃，酶解一段时间至水解度为4％。
[0046]
将预水解的小麦谷朊粉ph调节为7.0，加入0.005份淀粉酶(糖化酶)，0.005份葡萄糖氧化酶，恒定温度50℃，泵入空气，施加发散式超声处理(30w/l，50khz)并搅拌15min。
[0047]
经预处理的小麦谷朊粉补加0.02份中性蛋白酶，维持ph为6.5和温度为60℃，酶解一段时间至水解度为12％，反应结束经煮沸20min灭酶，离心取上清，喷雾干燥制得小麦低聚肽。所得小麦低聚肽的半胱氨酸含量为1.81％，游离氨基酸含量为4.9％，谷氨酰胺含量
为24.1％。
[0048]
以下通过动物实验例来说明本发明的有益效果。
[0049]
1、实验测试方法
[0050]
在某饲养基地，选取60只年龄在1～3岁，体重在1.5～4kg的表现健康的猫；选取60只年龄在1～6岁，体重在5～10kg的表现健康的犬。将犬猫分别随机分为10组，2组作为猫对比组，4组作为猫实验组；2组作为犬对比组，4组作为犬实验组。将这120只宠物犬猫运输至25公里外的新饲养基地(更换新品牌日粮)，犬、猫实验组1、2、3、4自由食用分别添加2％实施例1、2、3、4低聚肽的新品牌日粮，犬、猫对比组1、2自由食用分别添加2％对比例1、2制备低聚肽的新品牌日粮，连续2天后，第3天对所有犬猫排泄物进行观察并收集保存，在105℃烘箱中烘干至恒重，测定水分含量，结果表3和4所示。
[0051]
按下表对宠物排便情况进行评分，排便情况总得分＝排便次数得分+排便形态得分。
[0052]
表1宠物犬猫排便次数评分表
[0053][0054]
表2宠物犬猫排便形态评分表
[0055][0056]
2、实验结果
[0057]
如表3，猫对比组1、2的排泄物平均水分含量为85.6％、75.8％，实验组猫排泄物的水分含量最低为61.1％，较对比组改善明显；犬对比组1、2的排泄物平均水分含量为79.3％、74.4％，犬实验组的排泄物的水分含量最低为34.7％，较对比组改善明显，且犬的改善效果较猫更好。
[0058]
表3宠物犬猫排泄物水分含量测定
[0059]
[0060][0061]
由表4可见，喂食3天后，猫对比组1、2的排便情况平均得分为8.7和8.4，猫实验组1、2、3、4的排便情况平均得分分别为4.6、5.2、5.1和4.8，说明实施例1、2、3和4对改善宠物猫应激状态下排便情况效果较好，其中以实验组1和4最优，与对比组相比差异显著；犬对比组1、2的排便情况平均得分为8.5和8.2，犬实验组1、2、3和4的排便情况平均得分分别为3.0、3.4、2.6和3.1，说明实施例1、2、3和4对改善宠物犬应激状态下排便情况效果极佳，其中以实验组犬1和犬3最优，与对比组相比差异显著。
[0062]
表4宠物犬猫排便情况得分表
[0063][0064][0065]
上述具体实施方式仅是本发明的具体个案，本发明的专利保护范围包括但不限于
上述具体实施方式的产品形态和式样，任何符合本发明权利要求书且任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应落入本发明的专利保护范围。