一种层出镰刀菌的检测方法及其应用与流程

本发明涉及dna分子标记，尤其是涉及层出镰刀菌的检测方法及其应用于烟草镰刀菌根腐病的早期检测、预防和控制等。

背景技术：

1、烟草是我国重要的经济作物之一，是国家财税的重要经济来源，但病虫害的发生严重影响烟草生产。烟草镰刀菌根腐病是烟草主要土传病害之一，在烟草苗期至大田生长期均可发生，一般发生率为3％～5％，重病烟田的发病率可达30％以上，造成了严重的经济损失，且烟草镰刀菌根腐病的发生区域范围正逐渐扩大，严重制约着烤烟的可持续发展。烟草镰刀菌根腐病感病烟株地上部表现出长势较矮小，叶片发黄萎蔫自下而上；地下部根系组织不发达，主根或侧根有褐色坏死；湿度大时可致腐烂及白色霉层。我国于贵州首次报道烟草镰刀菌根腐病的发生，随后在全国陆续报道发生。

2、烟草镰刀菌根腐病病原为半知菌亚门镰刀菌属真菌，目前报道的烟草镰刀菌根腐病病原有尖孢镰刀菌(f.oxysporum)、茄病镰刀菌(f.solani)、层出镰刀菌(f.proliferatum)、木贼镰刀菌(f.equiseti)等。目前，烟草镰刀菌根腐病病原菌的检测鉴定主要依赖于传统的病原菌分离鉴定，主要包括症状观察、病原菌分离、显微形态观察及分子鉴定等，耗时较长，极不利于烟草镰刀菌根腐病的早期检测及预防。pcr检测是最常用的一种分子生物学检测方法，可通过快速扩增病原微生物的特异性核酸序列，实现病原菌的快速检测，近年来已在传染病、食源性致病菌污染、环境污染、肿瘤遗传标记等领域广泛应用，是比较成熟且应用范围最广的检测技术。但是现有的pcr检测烟草镰刀菌根腐病病原镰刀菌属下不同种的引物特异性不够高，检测的准确度比较低。关于层出镰刀菌的特异性引物尚无。层出镰刀菌是镰刀菌的一种，能够产生毒素，可侵染多种植物。目前，国内外已报道该病原菌能引起大豆根腐病、百合枯萎病菌、荸荠枯萎病、荷花腐败病及烟草根腐病等，给农业生产造成了严重的损失。

3、为克服上述缺陷，需研究人员筛选出对针对烟草镰刀菌根腐病病原菌层出镰刀菌特异性非常高的引物对，此过程须经历长时间的研究和反复的实践证明，且失败率极高。

技术实现思路

1、本发明正是为了解决上述问题缺陷，提供一种层出镰刀菌的检测方法及其应用。

2、本发明采用如下技术方案实现。

3、一种层出镰刀菌的检测方法，本发明所述的检测方法包括特异性引物组：正向引物fp-ef-spec1f：5′-atctggcggggtacatcttgg-3′；

4、反向引物fp-ef-spec1r：5′-aggttgtggacaggaaagg-3′。

5、本发明所述的特异性引物组fp-ef-spec1f/fp-ef-spec1r对应的扩展片段大小为293bp；序列为

6、atctggcggggtacatcttggaagacaacatgctgacatcgcttcacagaccggtcacttgatctaccagtgcggtggtatcgacaagcgaaccatcgagaagttcgagaaggttagtcactttcccttcgatcgcgcgtcctctgcccaccgatttcacttgcgattcgaaacgtgcctgctaccccgctcgagaccaaaaattttgcgatatgaccgtaatttttttggtggggcatttaccccgccactcgagcgatgggcgcgtttttgccctttcctgtccacaacct。

7、本发明所述的检测方法包括以下步骤：

8、s1：提取待检测样品dna；

9、s2：以待测样品为dna为模板，采用一对引物进行pcr扩增；

10、s3：扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析。

11、本发明所述步骤s1中提待检测样品dna的具体步骤如下：

12、s11：称取待检测样品0.1g左右，加液氮在研钵中用研磨棒研磨成细末，将细末转移至离心管中，加入600μl预热至65℃的ctab提取液，颠倒混匀，65℃水浴30～60min；所述步骤s11中的ctab提取液含2％巯基乙醇；

13、s12：取出离心管冷却至室温，加入600μl氯仿：异戊醇溶液，振荡混匀，12000rpm离心15min，取400μl上清液移至离心管中；所述步骤s12中的氯仿：异戊醇体积比为24:1；

14、s13：取上清液离心管中，加入等倍体积的预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置30min以上，12000rpm离心10min；

15、s14：去掉上清液，加入70％无水乙醇清洗1次，12000rpm离心10min；

16、s15：去掉上清液，加入95％无水乙醇再清洗1次，12000rpm离心5min，室温干燥后用适量无菌ddh2o溶解沉淀的dna，-20℃保存备用；所述步骤s15中无菌ddh2o替换为te溶液。

17、本发明所述步骤s2中pcr扩增的反应体系总体积为25μl，包括10×taq pcrbuffer 2.5μl，2.0μl dntp(各0.25mmol/l)，1.0u taq聚合酶(5u/μl)，1.0μl上下游引物(5×10-3mmol/l)，1μl模板dna，无菌ddh2o补足至25μl。

18、本发明所述步骤s2中pcr扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性1min，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃总延伸7min。

19、本发明所述步骤s3中琼脂糖凝胶电泳采用1％的琼脂糖凝胶，采用130v恒压电泳25min。

20、本发明上述检测方法在于烟草镰刀菌根腐病的早期检测、预防和控制中的应用。

21、本发明的应用在于，检测层出镰刀菌的灵敏度为1.0ng/μl。

22、本发明的应用在于，检测疑似被层出镰刀菌侵染的烟株最小时间为24小时。

23、本发明的有益效果为，1、现有技术中没有针对pcr检测烟草镰刀菌根腐病病原菌层出镰刀菌的特异性引物，本发明实现了零的突破；2、本发明研究筛选出的引物具有极高的准确度和特异性；3、综合使用本发明的方法，其最大灵敏度可达1.0ng/μl；4、本发明的应用在于检测疑似被层出镰刀菌侵染的烟株最小时间为24小时；5、本发明能在接种层出镰刀菌后早期检测到病原菌，达到烟草镰刀菌根腐病早期检测的目的，对于烟草镰刀菌根腐病的早期检测，预防和控制具有非常重要的意义和重大的经济意义。

24、下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。

技术特征：

1.一种层出镰刀菌的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括特异性引物组：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的特异性引物组fe-ef-spec1f/fe-ef-spec1r对应的扩展片段大小为293bp；序列为atctggcggggtacatcttggaagacaacatgctgacatcgcttcacagaccggtcacttgatctaccagtgcggtggtatcgacaagcgaaccatcgagaagttcgagaaggttagtcactttcccttcgatcgcgcgtcctctgcccaccgatttcacttgcgattcgaaacgtgcctgctaccccgctcgagaccaaaaattttgcgatatgaccgtaatttttttggtggggcatttaccccgccactcgagcgatgggcgcgtttttgccctttcctgtccacaacct。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述步骤s1中提待检测样品dna的具体步骤如下：

5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述步骤s2中pcr扩增的反应体系总体积为25μl，包括10×taq pcr buffer 2.5μl，2.0μl dntp各0.25mmol/l，1.0u taq聚合酶5u/μl，1.0μl上下游引物5×10-3mmol/l，1μl模板dna，无菌ddh2o补足至25μl。

6.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述步骤s2中pcr扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性1min，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃总延伸7min。

7.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述步骤s3中琼脂糖凝胶电泳采用1％的琼脂糖凝胶，采用130v恒压电泳25min。

8.如权利要求1或2所述检测方法在烟草镰刀菌根腐病早期检测、预防和控制中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用检测层出镰刀菌的灵敏度为0.1ng/μl。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用检测疑似被层出镰刀菌侵染的烟株最小时间为24小时。

技术总结
本发明涉及一种层出镰刀菌的检测方法及其应用，所述的检测方法包括特异性引物组：Fe‑EF‑spec1F/Fe‑EF‑spec1R。本发明有益效果为，1、现有技术中没有针对PCR检测烟草镰刀菌根腐病病原菌层出镰刀菌的特异性引物，本发明实现了零的突破；2、本发明研究筛选出的引物具有极高的准确度和特异性；3、综合使用本发明的方法，其最大灵敏度可达0.1ng/μL；4、本发明的应用在于检测疑似被层出镰刀菌侵染的烟株最小时间为24小时；5、本发明能在接种层出镰刀菌后早期检测到病原菌，达到烟草镰刀菌根腐病早期检测的目的，对于烟草镰刀菌根腐病的早期检测，预防和控制具有非常重要的意义和重大的经济意义。

技术研发人员：盖晓彤,冯智宇,姜宁,卢灿华,夏振远,马俊红,户艳霞,代快,王继明,韩天华
受保护的技术使用者：云南省烟草农业科学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11