一种在锈棕色链霉菌中高效表达葡萄糖异构酶的方法及重组突变体与流程

本发明涉及基因工程与蛋白质工程，具体涉及一种葡萄糖异构酶突变体及其应用。

背景技术：

1、葡萄糖异构酶（glucose isomerase, gi）也叫木糖异构酶（ec5.3.1.5），其能催化葡萄糖异构化为果糖，同时也能催化木糖异构化为木酮糖。由于果糖是饮料和食品的主要增甜剂，因此葡萄糖异构酶是最重要的工业酶之一。除此之外，戊糖和已糖也是葡萄糖异构酶良好的底物，包括d-核糖, l-阿拉伯糖, l-鼠李糖和 d-阿洛糖。gi也用于生产一些稀有糖类，这些稀有糖类在药物方面有重要应用，例如gi 能高效的催化l-阿拉伯糖变成 l-核糖, l-核糖是核苷类、糖基复合物和寡核苷类抗病毒和抗癌药物的重要组成部分。

2、在工业方面，gi最重要的用途是利用其催化葡萄糖变为果糖的活性，用于生产高果糖浆（hfcs）。果糖是一种天然的己酮糖,并且是已知的甜度最高的单糖，其富含于蜂蜜和水果中。果糖被预测为21世纪全球代替蔗糖、葡萄糖的新型功能性糖源。果糖可绕过糖酵解中的限速酶(磷酸果糖激酶)，在肝脏中果糖的分解速度快于葡萄糖。果糖代谢强度取决于果糖浓度，不受胰岛素的影响。因此人体摄入果糖不会引起摄入葡萄糖和蔗糖所容易引起的严重的饭后血糖高峰和低血糖等症状，消除了诱发糖尿病的潜在因素。因而是糖尿病人可以食用的健康糖。由于果糖具有低热值、保水特性、抗冻性、防腐特性、风味增强性和亲和性等特性，许多国家利用果糖来制造低能量食品、婴儿食品、病弱者食品等营养食品和疗效食品。欧美国家在糖果与饮料中基本不用蔗糖而用果糖。如加拿大法律规定，所有饮料必须使用高果糖浆作为增甜剂。据统计，2013年高果糖浆消耗量为107吨/年，是工业酶生产最多的产品，因此葡萄糖异构酶的用量也是巨大的。

3、目前全球的葡萄糖异构酶的生产主要由两家公司所垄断，为美国的杜邦公司和丹麦的诺维信公司。生产菌株大多数为锈棕色链霉菌（ streptomyces rubiginosus）和凝结芽孢杆菌（ bacillus coagulans）。

4、葡萄糖异构酶基因在原核生物中是普遍存在的，在大肠杆菌、链霉菌、乳酸菌等众多的微生物中均发现了葡萄糖异构酶基因。前期为了提高葡萄糖异构酶的表达，主要使用优化培养基的方法。前人发现在发酵培养基中加入d-木糖能提高葡萄糖异构酶的表达，但是d-木糖的添加提高了工业生产成本，后来发现添加淀粉、葡萄糖、山梨醇、甘油等能达到添加d-木糖的75%的效果。后来bejar s等人研究发现强启动子能提高葡萄糖异构酶的表达水平，将强启动子（p1）替换葡萄糖异构酶基因原来的启动子，发现该菌株与木糖诱导的野生菌相比，葡萄糖异构酶的表达水平提高了7倍。但是葡萄糖异构酶的表达水平依然较低，不能满足工业生产的需求。因此构建具有自主知识产权的葡萄糖异构酶高产菌株，减低生产成本，实现工业化生产，迫在眉睫。

技术实现思路

1、本发明的目的在于构建一株高产葡萄糖异构酶的锈棕色链霉菌菌株，以应用在工业生产中进行葡萄糖异构酶的生产。申请人首先构建得到重组表达葡萄糖异构酶基因的锈棕色链霉菌菌株，然后进一步对其进行紫外诱变，筛选获得葡萄糖异构酶产量显著提高的突变菌株，从而有利于降低该酶的生产成本，促进葡萄糖异构酶的广泛应用。

2、本发明一方面提供了一株高产葡萄糖异构酶的锈棕色链霉菌菌株工程菌株，其携带有表达葡萄糖异构酶基因。

3、所述葡萄糖异构酶的基因序列为seq id no:1，其编码的氨基酸序列为seq idno:2。

4、本发明一方面提供了一种突变菌株锈棕色链霉菌jkx102（ streptomyces  rubiginosus jkx102），已于2022年7月5日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no: m20221030。

5、本发明还提供了一种生产葡萄糖异构酶的方法，是以所述锈棕色链霉菌为发酵菌株。

6、本发明还提供了一种葡萄糖异构酶，是由所述锈棕色链霉菌发酵获得的。

7、有益效果

8、本发明首先将葡萄糖异构酶基因在锈棕色链霉菌宿主中表达，构建得到重组表达该酶的工程菌株锈棕色链霉菌jkx101。该菌株摇瓶发酵和15l罐发酵上清液中葡萄糖异构酶活分别达到62.5 u/ml和583.7 u/ml。

9、为了提高葡萄糖异构酶的产量，申请人以锈棕色链霉菌jkx101为出发菌株，进一步通过紫外诱变的方法筛选获得一株突变菌锈棕色链霉菌jkx102。该突变菌株摇瓶发酵上清液中葡萄糖异构酶高达94.6 u/ml，比出发菌提高的51.28%；其15 l罐发酵粗酶液中葡萄糖异构酶酶活高达925.3 u/ml，比出发菌提高了58.52%，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株可广泛应用于葡萄糖异构酶的生产，有利于降低葡萄糖异构酶的生产成本，促进该酶的应用。

技术特征：

1.一种葡萄糖异构酶，其特征在于，所述葡萄糖异构酶的氨基酸序列为seq id no:1，其编码核苷酸序列为seq id no:2。

2.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体携带有编码序列为seq id no：2的葡萄糖异构酶基因。

3.一种锈棕色链霉菌（streptomyces rubiginosus），其特征在于，所述锈棕色链霉菌包含权利要求1或2所述的重组表达载体。

4.一种锈棕色链霉菌突变菌，其特征在于，所述的锈棕色链霉菌突变菌是以权利要求3所述的锈棕色链霉菌工程菌为出发菌，通过紫外诱变获得的。

5.如权利要求4所述的锈棕色链霉菌突变菌，其特征在于，所述的锈棕色链霉菌突变菌的保藏编号为cctcc no: m20221030。

6.权利要求4或5所述的锈棕色链霉菌突变菌在生产果葡糖浆中的应用。

技术总结
本发明涉及基因工程技术领域，公开一种在锈棕色链霉菌中高效表达葡萄糖异构酶的方法及重组突变体。采用所述方法构建得到的锈棕色链霉菌工程菌能高产葡萄糖异构酶，且因不带抗生素筛选标记，绿色环保，能够保证葡萄糖异构酶生产的稳定性。本发明还提供了一株突变菌株锈棕色链霉菌JKX102，保藏编号为CCTCC NO:M20221030，其发酵酶活高达925.3 U/ml，比出发菌提高了约58.52%，可广泛应用于葡萄糖异构酶的生产，有利于降低生产成本，应用前景广阔。

技术研发人员：汪小杰
受保护的技术使用者：上海佶凯星生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13