一种用于自体动静脉内瘘血栓早期预警和诊断的分子标志物及其应用的制作方法

本发明属于医学生物检测，尤其涉及一种用于自体动静脉内瘘血栓早期预警和诊断的分子标志物及其应用。

背景技术：

1、自体动静脉内瘘(avf)是维持性血液透析(mhd)患者最主要的透析通路，能够保证患者获得充足的血流量，是维持性血液透析患者的“生命线”，因此其功能的正常运行决定了血液透析顺利完成。虽然自体动静脉内瘘具有使用寿命相对更长、维护成本低等诸多优势，但其使用寿命并非永久，内瘘血栓形成和血管通路狭窄是导致自体动静脉内瘘功能障碍的首要及主要原因。因此，对avf状态进行动态监测，及时发现内瘘部分血栓形成，防止完全血栓形成，在血栓形成前进行融栓等介入干预，从而延长动静脉内瘘使用时间是非常有必要的。

2、临床上常用的内瘘血栓检测方法包括听诊与触诊法的物理学检方法以及血管造影法和多普勒成像法的影像学检测方法。听诊与触诊法即医生根据临床应用经验采用目的观察和比较法判断瘘部是否正常，但该方法对临床医生的经验和要求比较高，难以大规模推广。血管造影法是自体动静脉内瘘血栓检测与评估的“金指标”，该方法优点是内瘘血栓判断准确高，但是，对于肾功能衰竭的患者来说，肾功能不全，水钠及电解质代谢十分紊乱，采用血管造影技术向血管注入造影剂进一步加大了肾脏的代谢负荷，虽诊断结果准确但是会造成机体的损伤，同时需要外科手术配合，另外血管造影设备庞大、价格昂贵且操作专业，不能满足病患日常实时监测需求。彩色多普勒超声检查目前是临床上检测和监测avf内瘘血栓形成的首选检查手段，具有无创性、价格便宜，高分辨率，但是截止目前，内瘘血管狭窄判断尚未有统一的指标。传统认为与相邻的相对正常的血管内径相比缩窄50％以上，psv>4m/s，但这种评价结果常取决于相邻的血管情况。而且，如果内瘘静脉段狭窄位于中心静脉时，往往由于骨质及肺部气体的影响，超声检查结果难以显示，确诊依然依赖血管造影技术。综上所述，临床上常用的内瘘血栓检测方法存在诊断标准准确性较低，会造成二次损伤，设备昂贵、无法实时动态监测血栓形成且发现内瘘血栓存在一定的滞后性等缺点。因此本领域亟需一种准确度更高、更高效、同时成本又低的监测方法。

3、基于血液检测标志物的筛查方案可以提供一种更高效准确低成本的的方法来监测avf血栓形成的风险。外泌体作为一种新型生物标志物，能够辅助疾病的早期诊断和实时动态监测疾病的发展进程。目前已知，mirna表达水平的异常变化与血栓形成相关，静脉血栓患者中，mirna-103a-3p，mir-338-5p表达量降低，mirna-320a，mirna-320b表达量升高。bi等证实血清外泌体mir-208a在急性冠脉综合征患者中高表达，有望成为急性冠脉综合征诊断标志物。于此同时，mir-122-5p，mir-21，mir-126，mir-204可以预测急性心血管事件的再发风险，可作为急性冠脉综合征病情评估及风险预测的可靠检测指标。血清外泌体mir-192，mir-194，和mir-34a可以作为预测急性心肌梗塞的生物标志物。wang等发现肺血栓栓塞患者的循环血小板外泌体(pmp)数量显著升高，提示pmp水平对pte具有预测价值，将血小板外泌体、血小板分布宽度、p-选择素和d-二聚体拟合成诊断标志物组合时诊断肺血栓栓塞具有较高的敏感性、特异性和准确性。

4、但是，外泌体与静脉血栓形成的的研究报道比较匮乏，血清外泌体mirna对动静脉内瘘血栓形成的诊断价值尚更是未见有研究结果报道。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于自体动静脉内瘘血栓早期预警和诊断的分子标志物及其应用。本发明使用血液外泌体mir-432-5p，mir-200a-3p和mir-144-5p作为早期预警和诊断自体动静脉内瘘血栓的分子标志物，并将其应用到自体动静脉内瘘血栓早期预警和诊断试剂盒、靶标、以及模型的构建中，通过分离鉴定血清外泌体、检测其中分子标志物的表达情况，然后使用构建的模型可准确预判自体动静脉内瘘中有无血栓的形成。使用本发明的分子标志物和应用，能显著提高自体动静脉内瘘血栓的早期预警和诊断效率，能有效延长自体动静脉内瘘的使用寿命。

2、为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

3、本发明提供了一种用于自体动静脉内瘘血栓早期预警和诊断的分子标志物，所述分子标志物为mir-432-5p，mir-200a-3p和mir-144-5p，其核苷酸序列分别如seq id no.1～seq id no.3所示。

4、本发明还提供了一种所述分子标志物在制备自体动静脉内瘘血栓早期预警和诊断试剂盒中的应用。

5、本发明还提供了一种所述分子标志物在构建自体动静脉内瘘血栓早期预警和诊断靶标中的应用。

6、本发明还提供了一种所述分子标志物在构建自体动静脉内瘘血栓早期预警和诊断模型中的应用，所述模型为：

7、p＝7.38-3.25(rtmir-432-5p)+0.967(rtmir-200a-3p)+1.52rt(mir-144-5p)；

8、所述rt(mir-432-5p)为mir-432-5p的相对表达量，所述rt(mir-200a-3p)为mir-200a-3p的相对表达量；所述rt(mir-144-5p)为mir-144-5p的相对表达量。

9、优选的，所述应用的具体操作步骤为：

10、(1)分离血清外泌体；

11、(2)检测外泌体中所述分子标志物的表达情况；

12、(3)使用所述模型预判有无血栓形成。

13、优选的，所述步骤(2)以u6为内参对照。

14、优选的，所述步骤(2)中的扩增反应体系如下表所示：

15、

16、优选的，所述步骤(2)中的扩增反应条件如下表所示：

17、

18、优选的，所述步骤(3)中使用的预判方法为：当p<1.08时，预判为无血栓形成；当p≥1.08时，预判为有血栓形成。

19、与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：

20、(1)本发明将血小板外泌体、血小板分布宽度、p-选择素和d-二聚体拟合成诊断标志物，用于自体动静脉内瘘血栓的早期预警和诊断中，具有敏感性高、特异性强和准确性高的优点；

21、(2)使用本发明的分子标志物和应用方法，能显著提高avf血栓早期预警和诊断效率，能有效延长自体动静脉内瘘的使用寿命。

技术特征：

1.一种用于自体动静脉内瘘血栓早期预警和诊断的分子标志物，其特征在于，所述分子标志物为mir-432-5p，mir-200a-3p和mir-144-5p，其核苷酸序列分别如seq id no.1～seq id no.3所示。

2.权利要求1所述的分子标志物在制备自体动静脉内瘘血栓早期预警和诊断试剂盒中的应用。

3.权利要求1所述的分子标志物在构建自体动静脉内瘘血栓早期预警和诊断靶标中的应用。

4.权利要求1所述的分子标志物在构建自体动静脉内瘘血栓早期预警和诊断模型中的应用，其特征在于，所述模型为：

5.根据权利要求2～4任一所述的应用，其特征在于，所述应用的具体操作步骤为：

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)以u6为内参对照。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中的扩增反应体系如下表所示：

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中的扩增反应条件如下表所示：

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中使用的预判方法为：当p<1.08时，预判为无血栓形成；当p≥1.08时，预判为有血栓形成。

技术总结
本发明提供了一种用于自体动静脉内瘘血栓早期预警和诊断的分子标志物及其应用，属于医学生物检测技术领域。本发明使用血液外泌体miR‑432‑5p，miR‑200a‑3p和miR‑144‑5p作为早期预警和诊断自体动静脉内瘘血栓的分子标志物，并将其应用到自体动静脉内瘘血栓早期预警和诊断试剂盒、靶标、以及模型的构建中，通过分离鉴定血清外泌体、检测其中分子标志物的表达情况，然后使用构建的模型可准确预判自体动静脉内瘘中有无血栓的形成。使用本发明的分子标志物和应用，能显著提高自体动静脉内瘘血栓的早期预警和诊断效率，能有效延长自体动静脉内瘘的使用寿命。

技术研发人员：刘好,罗敏虹,刘晔
受保护的技术使用者：深圳市拾方杰科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13