褐飞虱锚定蛋白基因NlGPI作为靶点在防治褐飞虱中的应用

本发明属于生物，具体涉及褐飞虱锚定蛋白基因nlgpi作为靶点在防治褐飞虱中的应用。

背景技术：

1、褐飞虱(nilaparvata lugens )隶属于半翅目飞虱科(hemiptera:delphacidae)，是危害我国水稻的重要害虫。褐飞虱不仅通过刺吸水稻韧皮部汁液和在水稻叶鞘中央产卵造成机械损伤，而且还能传播多种病毒性病害，造成我国粮食大面积欠收和减产。如何安全、有效防治褐飞虱，是当前褐飞虱防控工作中一个亟待解决的瓶颈问题。

2、褐飞虱腹部脂肪体中存在大量的类酵母共生菌(yeast-like symbiont,yls)，参与褐飞虱的固醇类物质代谢、氨基酸供给及氮素循环等生物进程，对褐飞虱的生长发育、繁殖和抗药性都发挥重要作用，因此yls有望成为褐飞虱防治的新靶标。对yls在褐飞虱体内垂直传递过程的深入研究有利于为褐飞虱防治提供新的思路。本发明前期研究表明，初羽雌虫的血淋巴中能检测到少量的yls，而羽化72h雌虫血淋巴中则存在大量的yls。为探明yls从脂肪体释放到血淋巴这一过程的影响因素和调控机制，我们对初羽雌虫(yls开始释放时间点)和羽化72h雌虫(yls大量释放时期)的脂肪体进行了转录组测序分析，发现锚定蛋白基因nlgpi表达在yls释放过程中存在显著差异。

3、gpi锚定蛋白是通过c端共价结合糖磷脂酰肌醇(glycolphosphatidylinositol，gpi)而锚定在膜上的蛋白质，在蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)中首次被发现。ferguson等人在布氏锥虫(brucei variant)体内成功分离到首个gpi分子并进行鉴定。gpi是一种结构复杂的糖脂类化合物，广泛存在于真核生物中。截止目前，已确证的gpi结构有50余个。许多低等或高等真核生物体内的膜表面蛋白及糖蛋白的c-末端以共价键的形式与gpi结合，形成gpi锚定蛋白并锚定于细胞质膜上，实质上gpi蛋白的出现是一种蛋白翻译后修饰的行为。gpi锚定蛋白主要锚定于细胞质膜的脂筏上，脂筏是一种质膜上的动态结构，富含胆固醇及鞘磷脂的微结构域。当gpi锚定蛋白大量合成并锚定于质膜后，它们会自发地形成gpi锚定蛋白簇。在过去的几十年里，通过对人体免疫t细胞和上皮细胞等细胞表面的研究发现，gpi在不同类型的细胞表面所形成的蛋白簇有所差异。因此可以推断gpi锚定蛋白簇的大小与多寡与细胞的类型以及细胞的外环境有关。至今已有250余种真核生物的膜蛋白被阐明通过gpi锚定的方式与质膜相连。gpi锚定蛋白在哺乳动物中的功能主要有激活免疫反应、促进精子的发生和发育、以及参与细胞间或细胞与环境之间的信号传导作用等。但gpi锚定蛋白在褐飞虱等昆虫中的作用尚未明确。

技术实现思路

1、为了探明gpi锚定蛋白在褐飞虱中的功能，尤其是在yls从脂肪体释放到血淋巴这一过程中所起的重要作用，本发明克隆了褐飞虱gpi锚定蛋白基因(nlgpi)，并对其cdna序列进行生物学分析以及时空表达模式分析，进而通过rnai技术对nlgpi进行功能初探，探明nlgpi在褐飞虱yls释放过程中的作用，为褐飞虱防治提供新的方向及理论基础。

2、为了实现以上发明目的，本发明提供了褐飞虱锚定蛋白基因nlgpi作为靶点在防治褐飞虱中的应用，所述nlgpi基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

3、具体的，本发明提供了褐飞虱锚定蛋白基因nlgpi作为靶点在制备防治褐飞虱药物中的应用。

4、本发明提供了一种褐飞虱锚定蛋白基因nlgpi的dsrna，所述dsrna由两条互补的核苷酸序列组成，正义链的核苷酸序列如seq id no.2所示，反义链的核苷酸序列如seq idno.3所示。

5、本发明还提供了所述褐飞虱锚定蛋白基因nlgpi的dsrna在防治褐飞虱虫害中的应用。

6、优选的，所述的应用为：以所述dsrna制备防治褐飞虱的药物。

7、本发明还提供了包含所述的dsrna的重组表达载体、重组微生物或转基因细胞系。

8、本发明还提供了一种防治褐飞虱的方法，所述方法包括将权利要求2所述的dsrna导入褐飞虱体内。

9、优选的，所述褐飞虱为若虫。

10、优选的，所述导入的方式为饲喂或注射。

11、本发明的实验结果表明：nlgpi基因具有明显的时空特异性，nlgpi在卵期至初羽基本不表达，羽化24h后表达水平开始显著增加，羽化后72h基因表达水平显著高于其他龄期。nlgpi在胸部、腹部、卵巢和肠道内的表达水平没有显著差异，但均显著高于头部的表达。rnai分析结果显示，nlgpi干扰后褐飞虱血淋巴中的yls数量显著下降，褐飞虱死亡率显著上升，产卵量及孵化率均显著下降。因此，nlgpi对褐飞虱体内yls释放至血淋巴这一过程紧密相关，并在褐飞虱的生长发育及繁殖过程中发挥重要作用，可作为褐飞虱防控的潜在靶标。

技术特征：

1.褐飞虱锚定蛋白基因nlgpi作为靶点在防治褐飞虱中的应用，其特征在于，所述nlgpi基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

2.一种褐飞虱锚定蛋白基因nlgpi的dsrna，所述dsrna由两条互补的核苷酸序列组成，正义链的核苷酸序列如seq id no.2所示，反义链的核苷酸序列如seq id no.3所示。

3.权利要求2所述褐飞虱锚定蛋白基因nlgpi的dsrna在防治褐飞虱虫害中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的应用为：以所述dsrna制备防治褐飞虱的药物。

5.包含权利要求2所述的dsrna的重组表达载体、重组微生物或转基因细胞系。

6.一种防治褐飞虱的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求2所述的dsrna导入褐飞虱体内。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述褐飞虱为若虫。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述导入的方式为饲喂或注射。

技术总结
本发明公开了褐飞虱锚定蛋白基因NlGPI作为靶点在防治褐飞虱中的应用。本发明基于褐飞虱转录组数据，利用PCR技术克隆NlGPI全长cDNA序列；利用生物信息学手段分析其核酸和蛋白质序列特征；通过qRT‑PCR技术检测其时空表达规律；利用RNAi技术探明NlGPI的生物学功能。本发明发现NlGPI对褐飞虱体内YLS释放至血淋巴这一过程紧密相关，并在褐飞虱的生长发育及繁殖过程中发挥重要作用，能够作为褐飞虱防控的潜在靶标。

技术研发人员：申屠旭萍,宋阳,熊振泽,俞晓平,李忠,许益鹏,刘光富
受保护的技术使用者：中国计量大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11