H7和H9亚型禽流感病毒双重纳米PCR检测的引物组、试剂盒及方法与流程

本发明属于分子生物学，特别涉及h7和h9亚型禽流感病毒双重纳米pcr检测的引物组、试剂盒及方法。

背景技术：

1、a型流感病毒根据病毒表面的血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)这两种蛋白可分为多个亚型。目前已知ha亚型有18种，na亚型有11种。例如，“h7n2病毒”是指具有ha蛋白和na蛋白的a型流感病毒亚型。除了h17n10 和h18n11亚型以外，所有已知的a型流感病毒亚型都可以感染鸟类，而 h17n10和h18n11亚型仅在蝙蝠中发现。

2、h7亚型病毒有9种不同亚型组合，已知的亚型包括h7n1、h7n2、h7n3、 h7n4、h7n5、h7n6、h7n7、h7n8和h7n9。在世界各地的野生鸟类和家禽中发现的大多数h7病毒是lpai病毒。h7病毒感染在人类中是罕见的。

3、1998年，首次出现人感染h9n2亚型aiv的病例，近年来不断有人感染h9n2 亚型aiv的报道，血清学研究结果表明从事家禽行业的人群h9n2亚型aiv 抗体率高达15％。另外，新型h7n9和h10n8亚型aiv的内部基因均来自 h9n2亚型aiv，导致人员感染并引起死亡，给公共卫生安全造成严重威胁。目前，禽流感病毒实验室检测技术主要包括病毒的分离及培养、血清学试验、分子生物学实验和免疫荧光等方法，且病毒的分离与培养是诊断禽流感病毒感染的“金标准”。由于禽流感亚型众多且新的变异株不断出现，使用上述检测方法对其进行分型和诊断不仅存在着操作方法复杂，而且检测周期长及容易受抗体等因素影响使得检测结果不能准确和及时。纳米pcr技术是在pcr反应的buffer中添加一定量的粒径为1～100nm的纳米金属颗粒，从而形成纳米流体，纳米流体具有极高的导热性，比普通流体要高得多，因此在添加了纳米金属颗粒的pcr热循环中，pcr反应能够更快地达到目标温度，从而缩短了在非目标温度停留的时间，不仅减少了非特异扩增，也提高了反应的特异性。随着纳米pcr技术的发展，人们不断地对该技术进行改良和优化。目前已经有纳米pcr技术检测多种动物病毒的报道，而双重纳米pcr(nano-dpcr) 技术反应同时扩增h7和h9 ha基因来检测和鉴别两种亚型aiv的核酸检测技术尚未见有报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供h7和h9亚型禽流感病毒双重纳米pcr检测的引物组、试剂盒及方法。

2、为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

3、本发明提供一种可通过双重纳米pcr检测h7和h9亚型禽流感病毒的引物组，包括引物h7-f、引物h7-r、引物h9-f、引物h9-r。引物h7-f的序列如seq id no.1所示，引物h7-r的序列如seq id no.2所示，引物h9-f 的序列如seq id no.3所示，引物h9-r的序列如seqid no.4所示。

4、含有上述引物组的试剂或试剂盒属于本发明的保护范围。

5、本发明提供了上述引物组在通过双重纳米pcr检测h7和h9亚型禽流感病毒的方法。

6、所述的方法，进一步包括以下步骤：

7、(1)提取待测样品的cdna；

8、(2)建立双重纳米pcr反应体系，利用上述引物组进行双重纳米pcr 反应；

9、(3)将pcr反应产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，当样品扩增出243bp 和622bp条带时，说明该样品为h7和h9亚型禽流感病毒；当样品只扩增出 243bp条带时，说明该样品为h7ny(y＝1-9)亚型禽流感病毒；当样品只扩增出622bp时，说明该样品为h9nx(x＝1-9)亚型禽流感病毒。

10、其中，步骤(2)中双重纳米pcr反应体系为2×nano-dpcr buffer 12.5μl， taqdna polymerase(5u/ul)0.8μl，作为模板h7亚型aiv和h5亚型aiv cdna各加入1μl，引物h7-f和h7-r(25pmol/μl)0.8μl、引物h9-f和h9-r (25pmol/μl)1.2μl，加ddh2o补足25μl。

11、其中，步骤(2)中双重纳米pcr反应条件为：最94℃3min；进入94℃ 20s，48℃20s，72℃30s，共30个循环；然后再72℃延伸5min，最后4℃结束反应。

12、本发明提供了上述引物组或含有该引物组的试剂盒在检测h7和h9亚型禽流感病毒中的应用。

13、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

14、本发明设计针对h7与h9亚型aiv基因的特异性引物，经过对不同引物组合进行试验筛选得到扩增效果较好的一个引物组合，然后继续对双重纳米 pcr反应体系中的引物浓度、引物之间的比例、退火温度和扩增时间进行优化，最终建立起可同时检测h7与h9亚型aiv的方法。

15、本发明的引物和检测方法通过一次纳米pcr反应便可同时确定样品中 h7与h9亚型aiv的混合感染及单一感染情况，特别是采用了纳米pcr这种新型的pcr技术，比普通pcr更敏感，比实时荧光定量pcr更方便快捷。该方法同时具有特异性强，检测灵敏度高，快速简便及易于操作等优点，十分适于在基层单位应用推广，为h7与h9亚型aiv的监测及其防控提供技术支撑。

技术特征：

1.一种通过双重纳米pcr检测h7和h9亚型禽流感病毒的引物组，包括引物h7-f、引物h7-r、引物h9-f、引物h9-r，其特征在于：引物h7-f的序列如seq id no.1所示，引物h7-r的序列如seq id no.2所示，引物h9-f的序列如seq id no.3所示，引物h9-r的序列如seq idno.4所示。

2.一种含有权利要求1所述引物组的试剂或试剂盒属于本发明的保护范围。

3.一种如权利要求1所述引物组在通过双重纳米pcr检测h7和h9亚型禽流感病毒的方法。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中双重纳米pcr反应体系为2×nano-dpcr buffer 12.5μl，taq dna polymerase(5u/ul)0.8μl，作为模板h7亚型aiv和h5亚型aiv cdna各加入1μl，引物h7-f和h7-r(25pmol/μl)0.8μl、引物h9-f和h9-r(25pmol/μl)1.2μl，加ddh2o补足25μl。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中双重纳米pcr反应条件为：最94℃3min；进入94℃20s，48℃20s，72℃30s，共30个循环；然后再72℃延伸5min，最后4℃结束反应。

7.权利要求1所述引物组或含有该引物组的试剂盒在检测h7和h9亚型禽流感病毒中的应用。

技术总结
本发明为H7和H9亚型禽流感病毒双重纳米PCR检测的引物组、试剂盒及方法，公开了一种通过双重纳米PCR检测H7和H9亚型禽流感病毒的引物组，包括引物H7‑F、引物H7‑R、引物H9‑F、引物H9‑R，引物H7‑F的序列如SEQ ID NO.1所示，引物H7‑R的序列如SEQ ID NO.2所示，引物H9‑F的序列如SEQ ID NO.3所示，引物H9‑R的序列如SEQ ID NO.4所示。本发明方法同时具有特异性强，检测灵敏度高，快速简便及易于操作等优点，十分适于在基层单位应用推广，为H7与H9亚型AIV的监测及其防控提供技术支撑。

技术研发人员：谢芝勋,李丹,李孟,罗思思,谢丽基,张民秀,黄娇玲,阮志华
受保护的技术使用者：广西壮族自治区兽医研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11