一种基于多重PCR的多靶标检测方法与流程

本发明涉及荧光定量以及多重pcr检测，具体为一种基于荧光定量pcr平台的多靶标检测方法。

背景技术：

1、荧光定量是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对pcr产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。

2、常规的荧光定量pcr由于单孔检测通道有限(一般4-6个通道)，如果需要检测多靶标，需要将检测样本分成较多份进行检测，但是将样本分成较多份数，会受到样本或核酸总体积以及靶标模板的拷贝有限的限制，或者需要将模板稀释导致检测灵敏度收到影响，为此，目前的荧光定量pcr对于单个样本能够进行同时检测的靶标数量非常有限，一般将样本分成3-4个孔位已经非常吃力。为此，本发明提供一种多重pcr的多靶标检测方法，在常规的荧光定量pcr平台上，可将轻松检测靶标的数目提高10倍以上，且不影响各靶标的检测灵敏度。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于多重pcr的多靶标检测方法，以解决上述背景技术中提出的目前的荧光定量pcr对于单个样本能够进行同时检测的靶标数量有限的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种多重pcr的多靶标检测方法，具体步骤包括如下：

4、s1.首先将样本中的核酸加入预扩增的pcr管中,该pcr管中预先放置了本次需要检测靶标的预扩增引物以及其它相关反应体系；

5、s2.将s1步骤中加入的核酸进行pcr扩增，这些检测靶标的核酸序列得到第一次富集；

6、s3.将s2步骤中的扩增产物分到多个常规荧光定量pcr管中，荧光定量pcr管预先放好不同靶标的引物或探针，第一轮预扩增的产物，可被这些引物扩增；

7、s4.将s3步骤中的多个荧光定量pcr管放入荧光定量pcr仪器中进行第二轮pcr扩增；

8、其中，s1～s3步骤中，检测靶标的扩增为超多重pcr预扩增，超多重pcr预扩增为第一轮扩增，超多重扩增的循环数为2～30次。

9、s3步骤中，预扩增的pcr管中上层为油相，下层为水项，pcr反应在下层水项中进行，该方法可以控制下一步分液操作时的气溶胶污染。

10、s4步骤中，第二轮扩增循环数为10～50次。

11、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

12、本方法在基于荧光定量pcr扩增区域，进行特殊引物设计进行预扩增，可以很好的解决样本分孔有限的问题，进而解决利用荧光定量pcr检测检测超多靶标难题。通过本方法的预扩增，可将扩增产物轻松的分成多个孔位且不影响检测性能，即通过本方法，对于单样本可轻松的将检测靶标数量相比于常规的方法提升10倍以上，同时采用本方法后，两轮扩增分别扩增的循环数有所减少，可以适当的减少气溶胶的干扰，也可以减少由于单引物由于循环数过多而导致的非特异信号。

技术特征：

1.一种基于多重pcr的多靶标检测方法,其特征在于：本发明主要是通过在荧光定量pcr扩增之前先对样本中的目标区域先进行超多重pcr预扩增，再将预扩增产物分液至荧光定量pcr的孔位中进行第二次扩增和荧光显色，具体步骤包括如下：

2.根据权利要求1所述一种基于超多重pcr的多靶标检测方法，其特征在于：s1～s3步骤中，多重pcr预扩增为第一轮扩增，可以原始模板直接进行第一次富集，多重预扩增的循环数为3～30个循环。

3.根据权利要求1所述一种基于多重pcr的多靶标检测方法，其特征在于：s1～s3步骤中：预扩增的pcr管中上层为油相，下层为水项，pcr反应在下层水项中进行，该方法可以控制下一步分液操作时的气溶胶污染。

4.根据权利要求1所述一种基于荧光定量pcr平台的多重靶标检测方法，其特征在于：s4步骤中，第二轮扩增循环数为10～50次。

技术总结
本发明公开了一种基于多重PCR的多靶标检测方法,本发明主要是通过在荧光定量PCR扩增之前先对样本中的目标区域先进行多重PCR预扩增，再将预扩增产物分液至各荧光定量PCR的孔位中进行第二次扩增和荧光显色，通过本方法的预扩增，可将扩增产物轻松的分成数十个孔位且不影响检测性能。即通过本方法，对于单样本可轻松的将检测靶标数量相比于常规的方法提升10倍以上，同时采用本方法后，两轮扩增分别扩增的循环数均有所减少，可以适当的减少气溶胶的干扰，也可以减少由于单引物由于循环数过多而导致的非特异信号。

技术研发人员：黄文潘,浦浩
受保护的技术使用者：上海冰缘医疗科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12