一种L-谷氨酸产量提高的谷氨酸棒杆菌的构建与应用

本发明涉及一种l-谷氨酸产量提高的谷氨酸棒杆菌的构建与应用，属于基因工程和发酵工程领域。

背景技术：

1、l-谷氨酸，化学名称为α-氨基戊二酸，化学式为c5h9no4，分子量为147.13，是一种酸性氨基酸。l-谷氨酸及其钠盐广泛应用于味精、香料、动物饲料和保健品的生产。

2、目前生产l-谷氨酸的主要方法是发酵法，用到的生产菌株主要是谷氨酸棒杆菌。谷氨酸棒杆菌具有独特的细胞壁结构，除了共价连接的肽聚糖和阿拉伯半乳聚糖外，还具有分枝菌酸层，该层结构与阿拉伯半乳聚糖层共价连接。分支菌酸层含有游离分支菌酸和分支菌酸糖脂，目前已知的能够与分支菌酸连接的糖有葡萄糖，海藻糖。分枝菌酸糖脂的减少会显著改变细胞的通透性，有利于氨基酸和其它高附加值的生物合成产物的外排。通过代谢工程改造获得谷氨酸棒杆菌分枝菌酸层精简的l-谷氨酸高产菌株具有重大的应用价值。

技术实现思路

1、为了解决上述存在的技术问题，本发明在谷氨酸棒杆菌中敲除谷氨酸棒杆菌基因组上海藻糖合成基因tres,trey,otsa得到突变菌谷氨酸棒杆菌△sya，谷氨酸棒杆菌△sya菌株在发酵培养基中，可以高效合成l-谷氨酸。

2、本发明的第一个目的是提供一种l-谷氨酸生产能力提高的重组谷氨酸棒杆菌，敲除或缺失了基因组上的海藻糖合成酶基因tres,麦芽寡糖基海藻糖合酶基因trey,海藻糖-6-磷酸合成酶基因otsa中的至少一个基因。

3、在一种实施方式中，所述海藻糖合成酶基因tres的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述麦芽寡糖基海藻糖合酶基因trey的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述海藻糖-6-磷酸合成酶基因otsa的核苷酸序列如seq id no.3所示。

4、在一种实施方式中，所述重组谷氨酸棒杆菌的出发菌株为谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13869。

5、本发明还提供了一种提高谷氨酸棒杆菌l-谷氨酸生产能力的方法，所述方法是抑制谷氨酸棒杆菌基因组上tres,trey,otsa中至少一个基因的表达。

6、在一种实施方式中，所述方法是敲除tres,trey和otsa基因。

7、本发明还提供所述重组谷氨酸棒杆菌在合成l-谷氨酸中的应用。

8、在一种实施方式中，所述应用是将所述重组谷氨酸棒杆菌在培养基中发酵生产l-谷氨酸。

9、在一种实施方式中，用于发酵的培养基含有：葡萄糖、玉米浆、酵母膏、(nh4)2so4、kh2po4、feso4、mgso4、维生素b1、caco3。

10、在一种实施方式中，所述发酵是将所述重组谷氨酸棒杆菌在28～35℃，150～250rpm下发酵至少60h。

11、在一种实施方式中，所述重组谷氨酸棒杆菌生产l-谷氨酸的方法具体为：将所述重组谷氨酸棒杆菌在活化培养基中培养36小时，接种到种子培养基中，于29～35℃，150～250rpm培养12-18小时得到种子液，再将种子液以初始od562为1的接种量接种于发酵培养基，置于29～35℃，150～250rpm条件下培养48～80小时。

12、本发明还提供所述重组谷氨酸棒杆菌，或上述方法在发酵、药物制备、材料或环保领域的应用。

13、有益效果：

14、本发明在谷氨酸棒杆菌中敲除谷氨酸棒杆菌基因组上海藻糖合成基因tres,trey,otsa，得到突变菌c.glutamicum△sya，c.glutamicum△sya菌株在发酵培养基中l-谷氨酸产量为14.75g/l，是c.glutamicum atcc13869的12.5倍，该研究提供了一种提高谷氨酸棒杆菌中l-谷氨酸产量的新策略。

技术特征：

1.一种l-谷氨酸生产能力提高的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，敲除或缺失了位于基因组上的海藻糖合成酶基因tres,麦芽寡糖基海藻糖合酶基因trey,海藻糖-6-磷酸合成酶基因otsa中的至少一个基因。

2.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述海藻糖合成酶基因tres的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述麦芽寡糖基海藻糖合酶基因trey的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述海藻糖-6-磷酸合成酶基因otsa的核苷酸序列如seq id no.3所示。

3.根据权利要求1或2所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌的出发菌株为谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13869。

4.一种提高谷氨酸棒杆菌l-谷氨酸生产能力的方法，其特征在于，抑制谷氨酸棒杆菌基因组上tres,trey,otsa中至少一个基因的表达。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，敲除tres,trey和otsa基因。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌atcc13869。

7.一种生产l-谷氨酸的方法，其特征在于，将权利要求1～3任一所述的重组谷氨酸棒杆菌在培养基中发酵合成l-谷氨酸。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵是将所述重组谷氨酸棒杆菌在28～35℃，150～250rpm下发酵至少60h。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，用于发酵的培养基含有：葡萄糖、玉米浆、酵母膏、(nh4)2so4、kh2po4、feso4、mgso4、维生素b1和caco3。

10.权利要求1～3任一所述的重组谷氨酸棒杆菌，或权利要求4～9任一所述的方法在发酵、药物制备、材料或环保领域的应用。

技术总结
本发明公开了一种L‑谷氨酸产量提高的谷氨酸棒杆菌的构建与应用，属于基因工程和发酵工程领域。本发明敲除谷氨酸棒杆菌基因组上海藻糖合成基因treS,treY和otsA基因，得到了L‑谷氨酸产量提升的重组菌株C.glutamicum△SYA，该菌株在发酵培养基中发酵60h的L‑谷氨酸产量为14.75g/L，是出发菌株C.glutamicum ATCC13869的12.5倍，有助于实现L‑谷氨酸的工业化生产。

技术研发人员：王小元,李贺丹,胡晓清,王建莉
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13