基于大肠杆菌展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法与流程

1.本发明属于蛋白质工程技术领域，特别涉及一种基于大肠杆菌展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法。


背景技术：

2.寡肽又称为小肽、低聚肽或称为小分子活性肽，2～10个氨基酸彼此缩合形成的化合物，是多肽的一种分类。在20世纪60年代出newey和smyth(1959,1960)第一次提供了肽被完整吸收的资料。蛋白质在小肠中被消化成氨基酸与寡肽，且寡肽可以完整的进入肠粘膜细胞并水解成氨基酸进入血液循环。寡肽具有不需要消化直接吸收、吸收时不消耗能量、不增加肠胃功能负担、100％被人体吸收等特点。
3.传统的寡肽合成主要分为化学合成和生物合成。化学合成利用固相或者液相介质，将肽链依照顺序逐个添加到合成中间产物上。这种化学合成的方法适用于二肽或者三肽的合成，但是对于长一点的寡肽的合成，就会出现反应步骤多，副产物和中间产物多，产量低和提纯困难等问题。生物合成是利用生物系统的蛋白表达技术，将寡肽融合蛋白表达在宿主内部，再经过蛋白纯化和寡肽释放来获得目的寡肽。这种方法的优势是不受寡肽长度和氨基酸序列的影响，可以简单高效地合成寡肽，副产物少，也是目前工业上合成寡肽的重要方法。但生物合成的方法还是需要经过菌株破碎和蛋白纯化的步骤，极大地提高了寡肽的生产成本，也降低了寡肽的合成规模，是寡肽生物合成的重要限速步骤。因此，开发免菌体破碎和蛋白纯化的寡肽生产工艺和提高寡肽的表达效率，对于寡肽的工业化生产而言，具有重要的价值，
4.1985年，smith gp第一次将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因ⅲ，创建了噬菌体展示技术。随着噬菌体表面展示技术的发展，表面展示技术成为表达和筛选蛋白和寡肽的重要技术。但是，噬菌体展示技术也存在大蛋白展示困难，噬菌体效价降低等缺陷。因此，在近些年，在细菌表面展示蛋白的技术被开发出来，细菌表面展示技术具有拷贝数多，表达蛋白大小限制小等优点，在蛋白互作、酶催化、靶标蛋白和抗体的筛选等领域具有重要的价值。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种基于大肠杆菌展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法。
6.为了达到上述目的，所采取的技术解决方案如下：
7.一种基于大肠杆菌展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法，其特征在于其步骤包括：
8.(1)构建用于在宿主菌表面展示寡肽的质粒，寡肽与展示蛋白之间使用内含肽连接，质粒载体可以选择lpp-ompa或in3；
9.(2)将质粒转入宿主菌中，诱导表达展示蛋白-内含肽-寡肽融合蛋白，诱导剂可以
使用异丙基硫代半乳糖苷(iptg)、乳糖、阿拉伯糖或者四环素等；
10.(3)离心收集细菌，内含肽自切割释放细菌表面的寡肽；
11.(4)离心分离寡肽和细菌，在离心力作用下(5000-10000rpm离心2-10min)，细菌在沉淀内，而寡肽在上清溶液中，寡肽经超滤后结晶或者干燥，获得寡肽晶体或粉末。
12.优选的，所述寡肽为长度在2-50个氨基酸的短肽。
13.优选的，所述寡肽为二肽-1、ap二肽、三肽-1、三肽-5、三肽-8、谷胱甘肽(gsh)、四肽-5、四肽-7、四肽-9、四肽-11、五肽-4、六肽-2、六肽-3、六肽-9、九肽-1、十肽-4。
14.优选的，所述宿主菌为大肠杆菌、芽孢杆菌、乳酸菌、恶臭假单胞菌或真氧产碱杆菌。
15.优选的，所述展示蛋白为大肠杆菌的omp家族系列蛋白、冰核蛋白inp、自转运蛋白ag43蛋白；芽孢杆菌的cot家族系列蛋白；乳酸菌的pgsa、bmpa、m6蛋白；恶臭假单胞菌的mate蛋白；或真氧产碱杆菌的fhua、iga、ompa。
16.优选的，所述内含肽是n端活性缺失的内含肽，即内含肽n端的半胱氨酸替换成无活性的其他氨基酸，如丙氨酸等。
17.优选的，步骤(2)中采用电转法或者氯化钙转化法将质粒转入宿主菌中。
18.优选的，步骤(3)中内含肽自切割释放细菌表面的寡肽指用高盐或低ph的条件激活内含肽的自切割活性，释放和游离细菌表面的寡肽。高盐指500mm的氯化钠，低ph指ph范围6-7。
19.优选的，步骤(4)中采用3kda的超滤膜，用超滤离心的方法分离寡肽和大分子蛋白，在超滤离心的作用下，寡肽穿过超滤膜，大分子蛋白截留在超滤膜上。
20.优选的，步骤(4)中分离的细菌可重复诱导表达展示蛋白-内含肽-寡肽融合蛋白。
21.本发明公开了一种基于细菌展示和自切割内含肽的寡肽表达和提纯技术，该技术将寡肽展示在细菌的表面，寡肽与展示蛋白之前使用内含肽连接。将构建的展示质粒转入宿主菌中，通过诱导产生展示蛋白-内含肽-寡肽融合蛋白，展示在宿主菌的表面。通过离心收集菌体，并激活内含肽的自切割活性释放出细菌表面的寡肽，再通过离心和超滤分离菌体和寡肽。这种方法简单高效，无需破碎菌体，也无需进行蛋白纯化，且细菌可以重复利用，是一种高效简便的寡肽生产和提纯工艺，非常适用于工业级规模的寡肽制备工艺。
附图说明
22.图1为lpp-ompa蛋白展示ddddk-寡肽质粒图谱。
23.图2为inp蛋白展示ddddk-寡肽质粒图谱。
24.图3为细菌展示ddddk-寡肽示意图。
25.图4为细菌展示寡肽和蛋白酶切割表达和提纯寡肽流程示意图。
26.图5为hplc检测基于大肠杆菌展示和蛋白酶切割方法表达和提纯的寡肽效果。
具体实施方式
27.下面通过表达纯化寡肽对噬菌体表面展示寡肽的纯化的构建及验证。对本发明做进一步说明，这些具体实施例不应以任何方式被解释为限制本发明的应用范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，
如无特殊说明，均可从商业途径得到。
28.本实施例公布了基于大肠杆菌表面展示寡肽的方法。将ssp-dnab内含肽和寡肽与lpp-ompa蛋白或者inp的c端融合,质粒图谱见图1和图2，利用大肠杆菌表面展示和制备寡肽的示意图见图3和图4。
29.构建好图1或图2图谱中的质粒后，转化到大肠杆菌bl21(de3)中，在含抗性的lb培养基固体平板中涂布，37℃培养过夜后，挑取单克隆在lb培养基中培养至od600值达到0.6-0.8，加入1mm终浓度iptg诱导4-12h后，5000rpm离心10min后，用pbs清洗沉淀2次后，加入含500mm nacl，ph6.5的pbs，在室温孵育过夜后，12000rpm离心取上清，使用3kd超滤管，8000rpm离心20min，流传液经hplc检测。沉淀用lb培养基悬浮后，加入iptg重新诱导表达展示寡肽。
30.利用细菌展示和内含肽自切割的寡肽表达和提纯技术表达了各种小分子肽，结果见图5和表1，提纯的寡肽产量高、纯度高。这说明本发明方法具有操作简单、成本低、产物产量和纯度高等特点，适用于大规模寡肽的工业化生产和制备。
31.表1
32.

技术特征：
1.一种基于大肠杆菌展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法，其特征在于其步骤包括：(1)构建用于在宿主菌表面展示寡肽的质粒，寡肽与展示蛋白之间使用内含肽连接；(2)将质粒转入宿主菌中，诱导表达展示蛋白-内含肽-寡肽融合蛋白；(3)离心收集细菌，内含肽自切割释放细菌表面的寡肽；(4)离心分离寡肽和细菌，寡肽经超滤后结晶或者干燥。2.权利要求1所述的基于大肠杆菌展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法，其特征在于：所述寡肽为长度在2-50个氨基酸的短肽。3.权利要求2所述的基于大肠杆菌展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法，其特征在于：所述寡肽为二肽-1、ap二肽、三肽-1、三肽-5、三肽-8、谷胱甘肽(gsh)、四肽-5、四肽-7、四肽-9、四肽-11、五肽-4、六肽-2、六肽-3、六肽-9、九肽-1、十肽-4。4.权利要求1所述的基于大肠杆菌展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法，其特征在于：所述宿主菌为大肠杆菌、芽孢杆菌、乳酸菌、恶臭假单胞菌或真氧产碱杆菌。5.权利要求4所述的基于大肠杆菌展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法，其特征在于：所述展示蛋白为大肠杆菌的omp家族系列蛋白、冰核蛋白inp、自转运蛋白ag43蛋白；芽孢杆菌的cot家族系列蛋白；乳酸菌的pgsa、bmpa、m6蛋白；恶臭假单胞菌的mate蛋白；或真氧产碱杆菌的fhua、iga、ompa。6.权利要求1所述的基于大肠杆菌展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法，其特征在于：所述内含肽是n端活性缺失的内含肽。7.权利要求1所述的基于大肠杆菌展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法，其特征在于：步骤(2)中采用电转法或者氯化钙转化法将质粒转入宿主菌中。8.权利要求1所述的基于大肠杆菌展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法，其特征在于：步骤(3)中内含肽自切割释放细菌表面的寡肽指用高盐或低ph的条件激活内含肽的自切割活性，释放和游离细菌表面的寡肽。9.权利要求1所述的基于大肠杆菌展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法，其特征在于：步骤(4)中采用3kda的超滤膜，用超滤离心的方法分离寡肽和大分子蛋白。10.权利要求1所述的基于大肠杆菌展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法，其特征在于：步骤(4)中分离的细菌可重复诱导表达展示蛋白-内含肽-寡肽融合蛋白。

技术总结
本发明涉及一种基于大肠杆菌展示和内含肽切割的寡肽表达和提纯方法，其步骤包括：(1)构建用于在宿主菌表面展示寡肽的质粒，寡肽与展示蛋白之间使用内含肽连接；(2)将质粒转入宿主菌中，诱导表达展示蛋白-内含肽-寡肽融合蛋白；(3)离心收集细菌，内含肽自切割释放细菌表面的寡肽；(4)离心分离寡肽和细菌，寡肽经超滤后结晶或者干燥。本发明方法简单高效，无需破碎菌体，也无需进行蛋白纯化，且细菌可以重复利用，是一种高效简便的寡肽生产和提纯工艺，非常适用于工业级规模的寡肽制备工艺。非常适用于工业级规模的寡肽制备工艺。非常适用于工业级规模的寡肽制备工艺。


技术研发人员：刘丽花 张志乾 罗元廷 江翱 吴奕瑞 赖诗静 王海梅 王嘉鹏
受保护的技术使用者：广州市乾相生物科技有限公司
技术研发日：2022.07.22
技术公布日：2022/10/18