一种检测海水鱼神经坏死病毒的单酶RT-qPCR体系

本发明设计分子生物检测，尤其是涉及一种利用rtx逆转录酶的rt-qpcr技术对海水鱼神经坏死病毒的检测。

背景技术：

1、大多数逆转录酶属于古老进化起源的单一蛋白家族，由于缺乏3′- 5′核酸外切酶校对结构域，这些聚合酶在反应过程中很容易出错。为了克服这个问题，安德鲁·艾灵顿的团队使用体外进化的策略，开发了一种高保真、耐热的dna聚合酶，被命名为逆转录聚合酶/逆转录异聚酶（rtx）。该酶能主动对rna和dna模板进行校对，大大提高了逆转录反应的保真度，且在98 ℃的高温下活性依然稳定。逆转录聚合酶链式反应（rt-pcr），主要关注的问题之一是使反转录和dna聚合反应在单管中同时进行，从而避免样品之间的交叉污染。rna病毒检测的另一关键问题是用于cdna合成的逆转录酶的热稳定性和可靠性。较高的反应温度有利于克服rna病毒基因组中经常存在的强大的二级结构。rtx的开发，能有效的解决以上两个问题，使单酶逆转录聚合酶链式反应中的rna模板直接扩增dna。rtx还被证实对rna模板有高效的处理能力，在rt-pcr过程中可以扩增出大于5 kb的片段。

2、荧光定量pcr（real-time pcr），利用荧光染料或探针可对pcr每个循环的扩增产物进行实时定量监测。在反应体系中加入sybr green染料，该染料不会发射任何荧光信号，从而确保荧光信号的增长和pcr扩增产物的增加完全同步，排除sybr green染料的影响。该方法操作简单，实验结果直观，近年被广泛应用于生物学研究。目前多数利用荧光定量pcr检测rna样本的技术，均需要先将rna样本逆转录为cdna，然后再以cdna为模板进行扩增，此过程至少需要两种酶，而本发明只需要单酶即可完成检测。降低样品交叉污染的概率和操作难度，缩短检测时间，提高检测效率，更有利于基层检测。

技术实现思路

1、发明目的：本发明提供一种用于海水鱼神经坏死病毒的单酶rt-qpcr检测体系

2、为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

3、一种检测海水鱼神经坏死病毒的单酶rt-qpcr方法，包括步骤：

4、1）提取待测样本总rna；

5、2）利用primer 5设计神经坏死病毒的rt-qpcr的上下游引物：正向引物，核苷酸序列为：gccaaatggtgggaaagca和反向引物，核苷酸序列为：agcggttgttgtctcctcaggtgtct；

6、3）将空白对照和待测样品进行检测；

7、4）可行性验证；

8、5）检测特异性验证；

9、6）rt-qpcr反应；

10、7）结果分析;

11、步骤1）中，采用fastpure cell/tissue total rna isolation kit，vazymecat.rc101-01抽提总rna;

12、步骤2）中引物的0.2 μm;

13、步骤3）中采用分子生物级别的无核酶水作为待测样本空白对照进行pcr扩增;

14、步骤4）中扩增体系如下：

15、

16、步骤5）中pcr反应条件如下：

17、

18、步骤6）中特异性验证样本包括：副溶血弧菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏杆菌、肺炎克雷伯杆菌rna;

19、步骤7）中采用优选qpcr设计分析软件实时pcr系统;

20、步骤8）中rt-qpcr反应体系如下：

21、

22、步骤9）中rt-qpcr反应条件如下：

23、

24、步骤10）中结果分析：在相应通道查看扩增曲线，根据扩增曲线判读结果，神经坏死病毒扩增曲线在第一通道，该通道扩增信号为“s”型曲线且ct值小于36，说明神经坏死病毒检测结果为阳性；副溶血弧菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏杆菌、肺炎克雷伯菌，分别在第2、3、4、5、6通道无扩增信号，且ct值大于36，证明扩增结果为阴性。

25、本发明用于检测神经坏死病毒的单酶rt-qpcr技术，实时检测信号可使实验更加精准，简单快速反应。在反应体系中加入rtx逆转录酶即可，不需要将rna反转录为cdna，集所有反应于一管，可大大的降低操作难度，缩短检测时间，提高检测效率，经济节约，性价比高，适用于基层快速检测。

技术特征：

1.一种检测海水鱼神经坏死病毒的单酶rt-qpcr体系，其特征在于，以下步骤：

2.如权利要求1所述步骤，所述1）中，采用fastpure cell/tissue total rnaisolation kit，vazyme cat.rc101-01试剂盒的操作步骤提取总rna。

3.如权利要求1所述步骤，所述3）中，引物终浓度为0.2 μm。

4.如权利要求1所述步骤，所述4）中，体系中所用酶为rtx反转录酶，包括但不限于同时具有依赖rna和dna模板的dna聚合酶活性的非重组酶。

5.如权利要求1所述步骤，所述4）中，进行pcr扩增，扩增体系为1 μl rtx逆转录酶，1.0μl权力要求1所述步骤，所述1）的rna，2.5 μl10×isothermal amplification buffer，1.8μl dntp mix(10 mm)，各0.5 μl权利要求1所述步骤，所述3）中的引物，2.5 μl甜菜碱（5m），15.2 μl无菌水。

6.如权利要求1所述步骤，所述4）中pcr反应扩增条件：60 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min，95℃ 15 s，55 ℃ 20 s，50个循环。

7.如权利要求1所述步骤，所述5）中，用分子生物级别的无核酶水作为试剂的空白对照。

8.如权利要求1所述步骤，所述6）中，用副溶血弧菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏杆菌、肺炎克雷伯杆菌的rna作为特异性检测的对照样本。

9.如权利要求1所述步骤，所述7）中，rt-qpcr 反应体系包括：1μl rtx逆转录酶，1.0 μl权力要求1所述步骤，所述1）的rna，2.5 μl10×isothermal amplification buffer，1.8μl dntp mix(10 mm)，各0.5 μl权利要求1所述步骤，所述3）中的引物，2.5 μl甜菜碱（5m），0.5 μl sybr green染料，14.7 μl无菌水。

10.如权利要求1所述步骤，所述7）中，rt-qpcr反应扩增条件：60 ℃，30 min，95 ℃，5min，95 ℃，15 s，55 ℃，20 s，50个循环，并采集荧光信号。

技术总结
一种检测海水鱼神经坏死病毒的单酶RT‑qPCR体系本发明提供一种利用RTX逆转录酶的RT‑qPCR检测石斑鱼神经坏死病毒的方法，包括以下步骤：1）取感染神经坏死病毒的石斑鱼的新鲜脑组织并提取RNA；2）设计并合成引物；3）制备反应体系；4）以待测的样本RNA为模板进行RT‑qPCR反应；5）获得荧光信号强度并进行结果分析及反应体系特异性试验。本发明利用单酶直接检测RNA病毒，集所有试剂于一管中进行一步反应，不需要分步实验，与常规RT‑qPCR实验相比，具有操作简单、低成本、快速等特点，有潜力成为临床检测和疫情监控的有力工具。

技术研发人员：宋凤阁,阳秀芬,王庆伟,王中飞雪,刘晨辉,王诗悦
受保护的技术使用者：海南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/25