神经母细胞瘤危险度分级标志物及其应用的制作方法

本发明属于分子诊断，具体涉及一组神经母细胞瘤危险度分级标志物及其应用。

背景技术：

1、神经母细胞瘤(neuroblastoma，nb)是儿童最常见的颅外恶性实体肿瘤，起源于胚胎神经脊，起病隐匿，进展迅速，占儿童癌症发病率的8％，却占儿童肿瘤死亡率的15％。神经母细胞瘤的特征是具有显著异质疾病谱性，包括广泛肿瘤患者在未经治疗的情况下自发退化或分化，以及尽管采用了强化多模式方法治疗，但耐药肿瘤但仍有转移扩散的现象，因此，个体差异显著。

2、基于诊断时的年龄、国际神经母细胞瘤分期系统(international neuroblastomastaging syste，inss)阶段、肿瘤组织mycn状态、国际神经母细胞瘤病理委员会(international neuroblastoma pathology committee，inpc)的分类和染色体倍体等，临床上，儿童肿瘤学组(children's oncology group，cog)将nb分为低危、中危和高危。低危nb、中危nb和高危nb患儿的5年无事件生存率和5年总生存率分别为91.3％和97.5％、85.1％和96.7％、37.7％和48.9％，可以看出高危nb患儿的生存率较低，迫切需要进一步提升。

3、研究表明，缺乏高危神经母细胞瘤(hr-nb)风险分类诊断模型和有效的治疗靶点是导致患儿生存率显著低于中低风险nb(lir-nb)的主要原因(van heerden,j.andm.kruger,management of neuroblastoma in limited-resource settings.world jclin oncol,2020.11(8):p.629-643.)。因此，对hr-nb进行系统研究，寻找其诊断生物标志物和异常代谢途径，有望提高hr-nb患儿的生存率。

4、现有技术中，主要依靠血、尿生物标志物，并进行ct、核磁、组织活检等系列检测后才能对nb进行危险度分级，且组织活检需要穿刺或者手术获得肿瘤组织才能进行，操作难度大，存在一定的风险，且检测成本高。

5、利用代谢组学能够表征样本中的所有小分子，以准确反映疾病状态的生物代谢特征，为疾病诊断和预后寻找新的生物标志物。转录组学通过高通量测序的方式从整体水平研究在特定时间和状态下在特定细胞、组织或个体中转录的所有mrna，揭示不同功能状态下基因表达和结构的差异。所以，采用代谢组学和转录组学的联合分析的方法有望发掘hr-nb中改变的代谢途径和诊断生物标志物，建立hr-nb早期诊断模型，寻找新的治疗靶点。

6、基于此，本发明通过筛选得到hr-nb分类诊断标志物，作为一种诊断工具，研究其在建立非侵入性、高特异性和高敏感性的nb危险度分级模型中的应用。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一组神经母细胞瘤危险度分级标志物及其应用，为高危神经母细胞瘤的分级提供一种有效的诊断工具。

2、本发明还包括采用荧光定量检测所述标志物的引物组合，以及所述标志物的获取方法。

3、为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：

4、一组标志物在制备神经母细胞瘤危险度分级药剂中的应用，所述标志物为基因标志物，所述标志物为fabp4、hbb、mgst1、s100a9、cxcl9、serpine1、mfap4、hmox1、cd36、cip2a、ube2c、kntc1、alk、il10、alpl、igf2、nxn、itga1、cdk2、chl1、tcf7l2、unc5d、erbb3、cga中的一种或两种以上的标志物组合

5、优选的，所述标志物为unc5d、s100a9、cdk2中的一种或两种以上的标志物组合。

6、进一步优选的，所述标志物为unc5d、s100a9、cdk2或三者的组合。

7、基于一个总的发明构思，本发明还包括检测所述标志物表达量的物质在制备神经母细胞瘤危险度分级产品中的应用。

8、具体的，检测所述标志物表达量的物质为引物或探针。

9、具体的，采用荧光定量检测所述标志物表达量，检测所述标志物的引物组合如下表所示：

10、

11、

12、具体的，采用荧光定量检测unc5d所用的上游引物序列如seq id no.1所示，检测unc5d所用的下游引物序列如seq id no.2所示。

13、具体的，采用荧光定量检测s100a9所用的上游引物序列如seq id no.3所示，检测s100a9所用的下游引物序列如seq id no.4所示。

14、具体的，采用荧光定量检测cdk2所用的上游引物序列如seq id no.5所示，检测cdk2所用的下游引物序列如seq id no.6所示。

15、进一步的，本发明还提供了一种包括所述标志物的神经母细胞瘤危险度分级产品。

16、具体的，所述产品为试剂、试剂盒或生物芯片。

17、与现有技术相比较，本发明的有益效果在于：

18、1、本发明对从临床神经母细胞瘤(neuroblastoma，nb)组织样本中对高危nb与中低危nb危险度分级潜在生物标志物进行筛选，并对临床nb组织样本进行转录组学分析，从24个潜在标志物中筛选获得3个nb危险度分级生物标志物(s100a9，cdk2，unc5d)。然后基于logistic回归分析建立了s100a9，cdk2，unc5d三个生物标志物用于对nb危险度进行分级的诊断模型，试验验证该模型对nb危险度分级诊断的灵敏度及特异性均为80％。本发明通过验证基于nb危险度分级的s100a9，cdk2，unc5d三个生物标志物在应用过程中具有无创、检测方便、灵敏度及特异性高等优势。

19、2、本发明采用基于逆转录链式反应(rt-pcr)的方法建立了一个基于非侵入性血浆的hr-nb风险分类诊断模型。本发明基于候选生物标志物的早期诊断模型对hr-nb的稳健风险评级和未来的靶向治疗具有重要意义。

20、3、本发明所述标志物可以用于制备神经母细胞瘤危险度分级试剂、试剂盒或生物芯片，通过检测受试者血浆中标志物的表达量，对nb进行快速分级诊断和判定，具有重要的临床应用价值。

技术特征：

1.一组标志物在制备神经母细胞瘤危险度分级药剂中的应用，其特征在于，所述标志物为fabp4、hbb、mgst1、s100a9、cxcl9、serpine1、mfap4、hmox1、cd36、cip2a、ube2c、kntc1、alk、il10、alpl、igf2、nxn、itga1、cdk2、chl1、tcf7l2、unc5d、erbb3、cga中的一种或两种以上的标志物组合。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述标志物为unc5d、s100a9、cdk2中的一种或两种以上的标志物组合。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测所述标志物表达量的物质在制备神经母细胞瘤危险度分级产品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，检测所述标志物表达量的物质为引物或探针。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，采用荧光定量检测所述标志物的引物组合如下表所示：

6.一种包括权利要求1所述标志物的神经母细胞瘤危险度分级产品。

7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述产品具体为试剂、试剂盒或生物芯片。

技术总结
本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一组神经母细胞瘤危险度分级标志物及其应用。本发明提供了一组标志物在制备神经母细胞瘤危险度分级药剂中的应用，所述标志物为基因标志物，所述标志物为FABP4、HBB、MGST1、S100A9、CXCL9、SERPINE1、MFAP4、HMOX1、CD36、CIP2A、UBE2C、KNTC1、ALK、IL10、ALPL、IGF2、NXN、ITGA1、CDK2、CHL1、TCF7L2、UNC5D、ERBB3、CGA中的一种或两种以上的标志物组合。本发明还包括采用荧光定量检测所述标志物的引物组合，以及所述标志物的获取方法。本发明采用基于逆转录链式反应（RT‑PCR）的方法建立了一个基于非侵入性血浆的HR‑NB风险分类诊断模型。本发明基于候选生物标志物的早期诊断模型对HR‑NB的稳健风险评级和未来的靶向治疗具有重要意义。

技术研发人员：张万存,杜邦,张现伟,侯立功,张飞,张耀东,李利锋,于志丹,梁莹,张孟欣,郜晶,孙萌,秦雪怡
受保护的技术使用者：河南省儿童医院郑州儿童医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11