用于鉴别柔嫩艾美耳球虫的野毒虫株和疫苗虫株的特异性引物对、鉴别产品及方法

本发明涉及分子生物学检测技术中的dna体外扩增，涉及一种用于鉴别柔嫩艾美耳球虫的野毒虫株和疫苗虫株的特异性引物对、鉴别产品及方法。

背景技术：

1、鸡球虫病是一种寄生于鸡肠上皮细胞内的原虫病，其中，柔嫩艾美耳球虫(eimeria tenella)的感染率和危害性最大。柔嫩艾美耳球虫主要通过球虫卵囊传播，并寄生于鸡盲肠部位。在临床发病特征中，感染柔嫩艾美耳球虫的养殖动物，特别是雏鸡，往往会出现精神沉郁，并伴有下痢，甚至血便等症状，同时生产性能显著降低，出栏量也严重受到影响。

2、从20世纪40年代起，鸡球虫病主要依靠抗球虫药物，例如莫能菌素、马杜拉霉素和海南霉素等已被开发和应用。然而，自20世纪70年代以来，抗药性鸡球虫的出现远远快于新药的开发。与此同时，药物使用不可避免地导致禽肉中药物残留的增加，这也引起了公众健康担忧。因此，目前鸡球虫病的控制，更多地采用活疫苗免疫方法。

3、不过，鸡球虫病的活疫苗也可定植于肠道组织，会影响临床样品的鸡球虫病分子检测结果。同时，鸡球虫病的活疫苗的使用过程中也存在毒力恢复的安全隐患。然而，如何实现鸡球虫病疫苗株和野毒株的鉴别目前还是研究空白。因此，基于鸡球虫病活疫苗的有效性和安全性考虑，建立鉴别鸡球虫的疫苗虫株和野毒虫株的方法刻不容缓。

4、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明实施例的目的之一包括提供用于鉴别柔嫩艾美耳球虫的野毒虫株和疫苗虫株的特异性引物对，采用该特异性引物对检测柔嫩艾美耳球虫，能够实现其野毒虫株和疫苗虫株的区分。

2、在本发明的第一方面，提供一种用于鉴别柔嫩艾美耳球虫的野毒虫株和疫苗虫株的特异性引物对，所述特异性引物对包括如seq id no.1所示的上游引物和如seq id no.2所示的下游引物。

3、在本发明的第二方面，提供一种柔嫩艾美耳球虫的野毒虫株和疫苗虫株的鉴别产品，所述鉴别产品包括在本发明的第一方面提供的特异性引物对，还包括其他鉴别试剂。

4、在本发明的一些实施方式中，所述鉴别产品包括pcr试剂盒、hrm试剂盒或者芯片。

5、在本发明的一些实施方式中，所述其他鉴别试剂包括pcr反应液和dna聚合酶中的一种或者多种。

6、在本发明的一些实施方式中，所述其他鉴别试剂包括阳性对照标准品和阴性对照标准品中的一种或者多种。

7、在本发明的一些实施方式中，所述其他鉴别试剂具有如下技术特征中的一个或者多个：

8、(1)所述阳性对照标准品选自柔嫩艾美耳球虫的野毒虫株的基因组dna、柔嫩艾美耳球虫的疫苗虫株的基因组dna、包含seq id no.3所示片段的重组载体和包含seq idno.4所示片段的重组载体中的一种或者多种；

9、(2)所述阴性对照标准品包括水。

10、在本发明的一些实施方式中，所述其他鉴别试剂包括hrm荧光染料。

11、在本发明的第第三方面，提供一种柔嫩艾美耳球虫的野毒虫株和疫苗虫株的鉴别方法，所述鉴别方法包括如下步骤：

12、提取待测样本的基因组dna；

13、采用在本发明的第一方面提供的特异性引物对，对所述基因组dna进行pcr扩增，检测所得pcr扩增产物，根据检测结果鉴别所述待测样本所含柔嫩艾美耳球虫的种类。

14、在本发明的一些实施方式中，检测所得pcr扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳法，根据检测结果鉴别所述待测样本所含柔嫩艾美耳球虫的种类包括：

15、若pcr扩增产物的泳道中出现263bp的条带，则所述待测样本含有柔嫩艾美耳球虫的野毒虫株；

16、若pcr扩增产物的泳道中出现219bp的条带，则所述待测样本含有柔嫩艾美耳球虫的疫苗虫株；

17、若pcr扩增产物的泳道中同时出现219bp的条带和263bp的条带，则所述待测样本同时含有柔嫩艾美耳球虫的野毒虫株和疫苗虫株。

18、在本发明的一些实施方式中，检测所得pcr扩增产物的方法为测序法，根据检测结果鉴别所述待测样本所含柔嫩艾美耳球虫的种类包括：

19、若pcr扩增产物的测序峰图为单一峰图且与seq id no.3完全匹配，则所述待测样本含有柔嫩艾美耳球虫的野毒虫株；

20、若pcr扩增产物的测序峰图为单一峰图且与seq id no.4完全匹配，则所述待测样本含有柔嫩艾美耳球虫的疫苗虫株。

21、相对于传统技术，本发明具备如下有益效果：

22、本发明基于对柔嫩艾美耳球虫的研究，设计出一对特异性引物，采用该引物对检测柔嫩艾美耳球虫，能够实现对其野毒虫株和疫苗虫株的区别，填补了目前柔嫩艾美耳球虫研究的空白。并且，发明人还发现，采用该引物对检测柔嫩艾美耳球虫的过程中，还能有效避免其他鸡球虫病病原虫虫株(例如巨型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫)的干扰。

23、本发明提供的特异性引物对，适用于pcr检测、hrm检测和芯片检测等，操作简单，重复性高。

24、采用该特异性引物对建立的鉴别方法有助于精准监测活疫苗免疫后鸡群的野毒感染情况，为鸡球虫的疫病防控提供参考。

技术特征：

1.用于鉴别柔嫩艾美耳球虫的野毒虫株和疫苗虫株的特异性引物对，其特征在于，所述特异性引物对包括如seq id no.1所示的上游引物和如seq id no.2所示的下游引物。

2.柔嫩艾美耳球虫的野毒虫株和疫苗虫株的鉴别产品，其特征在于，所述鉴别产品包括权利要求1所述的特异性引物对，还包括其他鉴别试剂。

3.根据权利要求2所述的柔嫩艾美耳球虫的野毒虫株和疫苗虫株的鉴别产品，其特征在于，所述鉴别产品包括pcr试剂盒、hrm试剂盒或者芯片。

4.根据权利要求2或者3所述的柔嫩艾美耳球虫的野毒虫株和疫苗虫株的鉴别产品，其特征在于，所述其他鉴别试剂包括pcr反应液和dna聚合酶中的一种或者多种。

5.根据权利要求2或者3所述的柔嫩艾美耳球虫的野毒虫株和疫苗虫株的鉴别产品，其特征在于，所述其他鉴别试剂包括阳性对照标准品和阴性对照标准品中的一种或者多种。

6.根据权利要求5所述的柔嫩艾美耳球虫的野毒虫株和疫苗虫株的鉴别产品，其特征在于，所述其他鉴别试剂具有如下技术特征中的一个或者多个：

7.根据权利要求2或者3所述的柔嫩艾美耳球虫的野毒虫株和疫苗虫株的鉴别产品，其特征在于，所述其他鉴别试剂包括hrm荧光染料。

8.柔嫩艾美耳球虫的野毒虫株和疫苗虫株的鉴别方法，其特征在于，所述鉴别方法包括如下步骤：

9.根据权利要求8所述的柔嫩艾美耳球虫的野毒虫株和疫苗虫株的鉴别方法，其特征在于，检测所得pcr扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳法，根据检测结果鉴别所述待测样本所含柔嫩艾美耳球虫的种类包括：

10.根据权利要求8所述的柔嫩艾美耳球虫的野毒虫株和疫苗虫株的鉴别方法，其特征在于，检测所得pcr扩增产物的方法为测序法，根据检测结果鉴别所述待测样本所含柔嫩艾美耳球虫的种类包括：

技术总结
本发明涉及一种用于鉴别柔嫩艾美耳球虫的野毒虫株和疫苗虫株的特异性引物对、鉴别产品及方法。特异性引物对包括如SEQ ID No.1所示的上游引物和如SEQ ID No.2所示的下游引物。采用该特异性引物对检测柔嫩艾美耳球虫，能够实现对其野毒虫株和疫苗虫株的区别，填补了目前柔嫩艾美耳球虫研究的空白。并且，发明人还发现，采用该引物对检测柔嫩艾美耳球虫的过程中，还能有效避免其他鸡球虫病病原虫虫株的干扰。本发明提供的特异性引物对，适用于PCR检测、HRM检测和芯片检测等，操作简单，重复性高。采用该特异性引物对建立的鉴别方法有助于精准监测活疫苗免疫后鸡群的野毒感染情况，为鸡球虫的疫病防控提供参考。

技术研发人员：孙铭飞,蔡海明,廖申权,戚南山,李娟,吕敏娜,林栩慧,胡俊菁,肖文婉,张小慧,张健騑
受保护的技术使用者：广东省农业科学院动物卫生研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12