一种产四甲基吡嗪的重组乳酸菌、其构建方法及其应用

本发明涉及一种产四甲基吡嗪的重组乳酸菌、其构建方法及其应用，属于基因工程。

背景技术：

1、目前重庆小曲酒生产普遍存在风味物质种类数量不足(主要骨架成分10种左右)，而杂醇油(以异戊醇计100mg/100ml以上)等杂质含量过高的问题。虽然课题组前期进行了复配小曲的研制，将重庆小曲白酒的主要风味物质从10多种提高到了30多种，但与大曲白酒的风味物质相比还有较大的差距。白酒的风味物质主要由微生物代谢产生，由于小曲白酒生产周期较短，完全通过环境微生物代谢产生风味物质来提高白酒品质十分困难，这也是重庆小曲白酒风味物质少、放香不足的根本原因，其次，由于重庆小曲白酒中微生物数量不如大曲白酒，不仅风味成分少，所含健康成分更少，如，四甲基吡嗪等一类明确的健康因子。如何提高重庆小曲白酒中的风味成分，尤其是对人体有益的健康成分是提高重庆小曲白酒品质的重要方面。

2、在研究过程中，发明人筛选出了两株产四甲基吡嗪较高的芽孢杆菌，产四甲基吡嗪分别为1.6g/l和0.78g/l，但是将这两株菌与复配小曲按不同配比进行组合，应用于实际生产后，结果表明，与复配小曲组合后的两株菌产四甲基吡嗪的量都很少，气相色谱几乎检测不出。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能够在白酒的窖池生产中产四甲基吡嗪工程菌、其构建方法及其应用。

2、为了解决现有技术存在的问题，发明人对“将高产四甲基吡嗪的芽孢杆菌与复配小曲组合后，产四甲基吡嗪的量很少且气相色谱几乎检测不出”这种现象的原因进行了深入研究。发明人通过高能量测序分别对小曲白酒发酵期中各阶段的酒糟进行微生物群落及多样性分析，结果表明，进入窖池的2天开始，芽孢杆菌属的数量急剧下降，在发酵第3～7天主要优势菌属为乳杆菌属，酵母菌属在发酵第2天到发酵结束相对丰度平稳提高。由此可知，产四甲基吡嗪少的主要原因是芽孢杆菌属的数量不足，由于入窖后氧浓度不断下降抑制了芽孢杆菌类好氧微生物的生长，而兼性厌氧的乳酸菌数量增加较大。

3、针对上述问题的发生原因，发明人利用基因工程技术将高产四甲基吡嗪的芽孢杆菌中代谢乙偶姻的基因克隆出来，与载体连接构建质粒，然后转入到乳酸菌中，进行代谢表达，构建了产四甲基吡嗪工程菌。在着力提高小曲的产香能力，改善小曲酒放香不足的同时，也提高小曲酒中健康因子的含量。在整个过程中，通过gc分析检测各项指标。并逐级放大到中试及生产中，进一步验证工程菌的生产性能，摸索其在白酒实际生产中产风味物质的情况。

4、本发明的技术方案如下：

5、在本发明的第一方面，提供了一种产四甲基吡嗪的重组乳酸菌。

6、所述的重组乳酸菌，以乳酸菌为宿主，包括核苷酸序列如seq id no.1所示的乙偶姻操纵子基因；该菌株已于2022年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctcc no：m 2022430。

7、在本发明的第二方面，提供了一种如第一方面所述产四甲基吡嗪的重组乳酸菌的构建方法。

8、所述的构建方法步骤如下：

9、1)将核苷酸序列如seq id no.1所示的乙偶姻操纵子基因片段，插入到质粒pmg36e载体上的xba i和pst i限制性酶切位点之间，使核苷酸序列位于启动子的下游并受其调控，构建重组表达质粒pmg36e-als；

10、2)用步骤2)得到的重组表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞，获得初步重组菌，并提取初步重组菌中的重组质粒；

11、3)用步骤3)提取的重组质粒转化乳酸菌感受态细胞，得到产四甲基吡嗪的重组乳酸菌。

12、优选地，所述的大肠杆菌感受态细胞为e.coilmc1061。

13、优选地，所述的乳酸菌感受态细胞为nz9000。

14、在本发明的第三方面，提供了利用第一方面所述的产四甲基吡嗪的重组乳酸菌产四甲基吡嗪的方法。

15、所述的方法步骤如下：

16、1)将产四甲基吡嗪的重组乳酸菌置于发酵罐中进行发酵，诱导乙偶姻操纵子基因表达，得到发酵液；

17、2)将得到的发酵液在水浴锅中100℃蒸煮10min，使其发生非酶促的美拉德反应，使乙偶姻与氨反应得到产物四甲基吡嗪。

18、在本发明的第四方面，提供了如第一方面所述的产四甲基吡嗪的重组乳酸菌在重庆小曲生产中的应用。

19、本发明具有如下技术效果：

20、1)本发明通过将高产四甲基吡嗪的芽孢杆菌中代谢乙偶姻的基因与载体连接构建质粒，然后转入到乳酸菌中，获得一种新的重组乳酸菌。

21、2)从实施例2可以看出，本发明的重组乳酸菌在用于复配小曲的制备过程中，能够不受窖池氧浓度不断下降的影响，依然能够高产四甲基吡嗪。

22、本发明涉及到的微生物的保藏信息如下：

23、保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)；

24、保藏单位地址：中国武汉；

25、分类命名：lactococcus lactis fpx-1；

26、保藏编号：cctcc no：m 2022430；

27、保藏日期为：2022年4月27日。

技术特征：

1.一种产四甲基吡嗪的重组乳酸菌，其特征在于，所述的重组乳酸菌，以乳酸菌为宿主，包括核苷酸序列如seq id no.1所示的乙偶姻操纵子基因；该菌株已于2022年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctcc no：m 2022430。

2.如权利要求1所述产四甲基吡嗪的重组乳酸菌的构建方法，其特征在于，所述的构建方法步骤如下：

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的大肠杆菌感受态细胞为e.coilmc1061。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的乳酸菌感受态细胞为nz9000。

5.使用如权利要求1所述的产四甲基吡嗪的重组乳酸菌产四甲基吡嗪的方法，其特征在于，所述的方法步骤如下：

6.如权利要求1所述的产四甲基吡嗪的重组乳酸菌在重庆小曲生产中的应用。

技术总结
本发明提供了一种产四甲基吡嗪的重组乳酸菌、其构建方法及其应用。本发明的产四甲基吡嗪的重组乳酸菌，所述的重组乳酸菌，以乳酸菌为宿主，包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的乙偶姻操纵子基因；该菌株已于2022年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2022430。本发明还提供了所述的产四甲基吡嗪的重组乳酸菌在重庆小曲生产中的应用。本发明具有如下技术效果：1）本发明通过将高产四甲基吡嗪的芽孢杆菌中代谢乙偶姻的基因与载体连接构建质粒，然后转入到乳酸菌中，获得一种新的重组乳酸菌。2）本发明获得的重组乳酸菌在用于复配小曲的制备过程中，能够不受窖池氧浓度不断下降的影响，依然能够高产四甲基吡嗪。

技术研发人员：王庆,韩国强,向小青
受保护的技术使用者：长江师范学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13