一种芒果耐盐基因及其鉴定方法和应用

本发明属于农业生物，具体涉及一种芒果耐盐基因及其鉴定方法和应用。

背景技术：

1、随着全球气候变化的加剧，海水倒灌和土壤盐碱化成为日益严重的问题。在此背景下，赋予农作物耐盐功能是农业对抗气候变化的重要手段。虽然培育耐盐作物是长期以来育种家的育种目标，然而真正具有耐盐特性的作物寥寥无几。其主要原因是，当前主要作物，如水稻、小麦、玉米、烟草等，鲜有耐盐野生和农家种的种质资源；而耐盐植物，如海草、红树等，与主要作物亲缘关系较远，无法通过传统的育种方法，如杂交等，将相应的耐盐特性引入主要作物。此外，一些种植面积较小的作物，如芒果、腰果、滨豇豆等，在农家种和野生种质资源中常常发掘到具有优良耐盐特性的植株。如何利用这些耐盐植物和小众作物的耐盐植株是当前作物耐盐育种的重要问题。

2、随着转基因技术的成熟，将耐盐植物和小众作物的耐盐植株的耐盐基因挖掘出来，并通过转基因技术将相应基因引入到主要作物，是一个培育耐盐作物品种的较为有效的途径。该途径可分解为两步：挖掘耐盐基因，和引入耐盐基因。转基因手段在很多作物中已经相当成熟，然而可供利用的耐盐基因非常少。其主要原因是缺乏挖掘耐盐基因的有效手段。

3、本发明聚焦于一种耐盐芒果植株，我们将其命名为农院3号。该植株发现于海南省昌江黎族自治县下园村，该植株位于昌化江入海口的岸边，潮汐的海水常将其根部淹没。尽管有不利的盐胁迫的影响，该植株仍然生长健壮，连年结果丰硕。采集该株植株所结的种子，发芽所得的幼苗，仍然具有优良的耐盐特性。在本发明中，我们将其与不耐盐的商品芒果品种台农1号同时进行盐胁迫，通过分析基因共表达网络的差异，发掘耐盐植株农院3号中的耐盐关键基因，并将其通过转基因用于培育耐盐烟草植株。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中的不足，利用高通量测序和生物信息学从芒果耐盐植株中鉴定负责耐盐特性的关键基因，以及通过转基因的方式将该基因在烟草中表达，从而获得烟草耐盐植株。

2、本发明的第一个方面是提供一种芒果耐盐基因，其核苷酸序列如seq id no:2所示。

3、本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的芒果耐盐基因编码的蛋白，其氨基酸序列如seq id no:4所示。

4、本发明的第三个方面是提供一种重组载体，其包含原始载体和本发明第一个方面所述的芒果耐盐基因的编码区。

5、其中，所述原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体采用pcambia1301载体质粒，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒、或者病毒等。

6、优选地，所述原始载体为pcambia1301载体质粒，seq id no:2所示核苷酸序列与pcambia1301载体质粒经ncoi和nhei两种限制性内切酶双酶切连接。

7、本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的芒果耐盐基因、或者本发明第三个方面所述的重组载体在提高植物耐盐性中的应用。

8、盐胁迫时，本发明第一个方面所述的芒果耐盐基因、或者本发明第三个方面所述的重组载体能降植株低氯离子含量、增大植株叶面积、维持植株叶绿素含量、提高植株可溶性糖含量、提高植株脯氨酸含量等。

9、本发明的第五个方面是提供一种获得烟草耐盐植株的方法，采用本发明第一个方面所述的芒果耐盐基因、或者权利要求3所述的重组载体转染烟草植株。

10、优选的，所述方法包括以下步骤：构建含有第一个方面所述的芒果耐盐基因的编码区的重组载体；将重组载体转化根癌农杆菌；采用农杆菌介导的叶盘转化法，将重组载体导入烟草。

11、本发明的第六个方面是提供一种从芒果耐盐植株中鉴定得到耐盐基因的方法，将耐盐和不耐盐的芒果植株同时进行盐胁迫处理，在处理后一定时间提取各自根部rna，建库测序后，进行高通量测序，确定所有芒果基因表达量，并通过差异表达分析和共表达分析的结合从芒果耐盐植株中鉴定得到芒果耐盐基因，其核苷酸序列如seq id no:2所示。

12、本方法能从3万余芒果基因中，高效地筛选得到耐盐基因，并阐释其序列和表达特性，并能将其通过转基因的方式在烟草中异源表达，从而获取烟草耐盐植株的方法。该方法具有效率高、成本低、用时短的特点，特别是，通过本发明可以准确地从芒果耐盐材料中鉴定到耐盐基因，并将该基因在烟草中表达获得耐盐植株，可应用于芒果高效基因挖掘鉴定和烟草耐盐植株的培育，对于芒果基因鉴定和耐盐烟草品种培育具有重要意义。本发明中鉴定得到的基因具有很好的耐盐特性，本发明涉及的方法还可推广到其它作物重要经济性状相关基因的鉴定和其它作物转基因材料的获取，因此具有很好的推广价值。

13、本发明的第七个方面是提供本发明第一个方面所述的芒果耐盐基因对应的非耐盐基因，其核苷酸序列如seq id no:1所示。

14、本发明的第八个方面是提供本发明第七个方面所述的非耐盐基因编码的蛋白，其氨基酸序列如seq id no:3所示。

15、本发明的第九个方面是提供另一种重组载体，其特征在于，其包含原始载体和本发明第七个方面所述的非耐盐基因的编码区。

16、本发明的第十个方面是提供本发明第七个方面所述的非耐盐基因、或者本发明第九个方面所述的重组载体在从芒果耐盐植株中鉴定得到本发明第一个方面所述的芒果耐盐基因中的应用。

17、本发明的有益效果在于：

18、(1)本发明中，通过比较耐盐和不耐盐的芒果植株在盐胁迫后基因表达的差异，以及通过比较两者共表达网络关键节点的差异，挖掘到了芒果耐盐关键基因，并通过序列分析，鉴定到了核苷酸和氨基酸的差异；该方法避免了传统的单独通过差异表达分析或者共表达分析鉴定出上百个、甚至上千个基因，从而无从下手最终导致无法鉴定出单个关键基因的缺点。

19、(2)本发明挖掘到了耐盐基因，将其通过根癌农杆菌介导的遗传转化的方法导入烟草植株，从而成功地获得了烟草耐盐植株。通过该方法，可以将该基因应用于水稻、玉米、大豆等其它转基因组体系成熟的作物耐盐植株的获取，具有良好的应用前景。

20、(3)本发明所述的基因挖掘和烟草耐盐植株获取方法操作步骤明确，方法可复制性强，可应用于植物中其它抗逆相关基因的挖掘以及抗逆植株的获取。

技术特征：

1.一种芒果耐盐基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no:2所示。

2.权利要求1所述的芒果耐盐基因编码的蛋白，其氨基酸序列如seq id no:4所示。

3.一种重组载体，其特征在于，其包含原始载体和权利要求1所述的芒果耐盐基因的编码区。

4.如权利要求1所述的芒果耐盐基因、或者权利要求3所述的重组载体在提高植物耐盐性中的应用。

5.一种获得烟草耐盐植株的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的芒果耐盐基因、或者权利要求3所述的重组载体转染烟草植株。

6.一种从芒果耐盐植株中鉴定得到耐盐基因的方法，其特征在于，将耐盐和不耐盐的芒果植株同时进行盐胁迫处理，在处理后一定时间提取各自根部rna，建库测序后，进行高通量测序，确定所有芒果基因表达量，并通过差异表达分析和共表达分析的结合从芒果耐盐植株中鉴定得到芒果耐盐基因，其核苷酸序列如seq id no:2所示。

7.权利要求1所述的芒果耐盐基因对应的非耐盐基因，其核苷酸序列如seq id no:1所示。

8.权利要求7所述的非耐盐基因编码的蛋白，其氨基酸序列如seq id no:3所示。

9.一种重组载体，其特征在于，其包含原始载体和权利要求7所述的非耐盐基因的编码区。

10.权利要求7所述的非耐盐基因、或者权利要求9所述的重组载体在从芒果耐盐植株中鉴定得到权利要求1所述的芒果耐盐基因中的应用。

技术总结
本发明提供了一种芒果耐盐基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明还提供了芒果耐盐基因的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。本发明还提供了包含所述芒果耐盐基因的编码区的重组载体。本发明通过比较耐盐和不耐盐的芒果植株在盐胁迫后基因表达的差异，以及两者共表达网络关键节点的差异，挖掘到芒果耐盐关键基因，将其通过根癌农杆菌介导的遗传转化的方法导入烟草植株，成功地获得了烟草耐盐植株。通过该方法，可以将该基因应用于水稻、玉米、大豆等其它转基因组体系成熟的作物耐盐植株的获取，具有良好的应用前景。

技术研发人员：王鹏,叶秀旭
受保护的技术使用者：中国热带农业科学院三亚研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12